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Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

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DOI:

10.3791/66234

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29 de março de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Tecnológico de Monterrey, 3Diabetes Research Institute, Miller School of Medicine, University of Miami

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Resumo

Estudos biomédicos do fígado em mamíferos são dificultados pela falta de métodos para imagens longitudinais não invasivas in vivo com resolução celular. Até agora, a imagem óptica do fígado in situ é possível por imagem intravital, que oferece imagens de alta resolução no nível celular, mas não pode ser realizada várias vezes e, portanto, longitudinalmente no mesmo animal. Métodos de imagem não invasivos, como a bioluminescência, permitem sessões de imagem repetidas no mesmo animal, mas não atingem a resolução celular. Para resolver essa lacuna metodológica, desenvolvemos uma plataforma para imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. No fluxo de trabalho descrito neste estudo, esferoides primários do fígado de camundongos são gerados in vitro e transplantados para a câmara anterior do olho de camundongos receptores, onde são enxertados na íris. A córnea atua como uma janela natural do corpo através da qual podemos obter imagens dos esferoides enxertados por microscopia confocal convencional. Os esferoides sobrevivem por meses no olho, durante os quais as células podem ser estudadas em contextos de saúde e doença, além de serem monitoradas em resposta a diferentes estímulos em sessões repetidas de imagem usando sondas fluorescentes apropriadas. Neste protocolo, fornecemos uma análise das etapas necessárias para implementar esse sistema de imagem e explicamos como aproveitar melhor seu potencial.

Introdução

O monitoramento da função hepática em mamíferos durante a saúde e a doença é limitado pela falta de técnicas de imagem in vivo não invasivas e de alta resolução. A visualização desse órgão é dificultada por sua localização inacessível e, para reunir os processos celulares, os estudos in vivo contam com o sacrifício de animais em diferentes momentos. Para contornar essa limitação de imagem, muitos trabalhos dependem de modelos in vitro , nos quais microtecidos semelhantes ao fígado são visualizados e estudados em um ambiente controlado.

Nos últimos anos, o desenvolvimento de sistemas de cultura tridimensionais, como esferoides hepáticos, tem auxiliado e avançado a pesquisa hepática. Os esferoides hepáticos são agregados multicelulares que imitam o microambiente e as complexas interações célula-célula do tecido hepático até certo ponto1 e oferecem vantagens claras sobre as culturas tradicionais de monocamada 2,3. Os esferoides hepáticos também são usados como modelos para diferentes doenças hepáticas 4,5,6 e têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença. Ainda assim, as principais limitações dos atuais modelos hepáticos in vitro são a falta de um meio fisiológico in vivo e o tempo limitado de utilização em cultura (cerca de 20 dias)3. Os esferoides hepáticos foram previamente transplantados para diferentes locais in vivo, como sob a cápsula renal7 ou intraperitonealmente8, que não são acessíveis para imagens ópticas. A imagem intravital do fígado é uma técnica de última geração que oferece imagens em tempo real com resolução celular. Atualmente, essa imagem hepática in situ só é possível no órgão exteriorizado, que é altamente invasivo e muitas vezes terminal9. Embora a adaptação de uma janela abdominal permita sessões repetidas de imagem do fígado, ela envolve cirurgia complexa e cuidados posteriores.

Para realizar o monitoramento longitudinal em resolução celular, exploramos o transplante de esferoides hepáticos para a câmara anterior do olho (ECA) de camundongos, onde o tecido semelhante ao fígado é enxertado em um meio fisiológico, conectado aos estímulos corporais e acessível para imagens ópticas. A córnea é um tecido transparente e atua como uma janela através da qual os microtecidos enxertados na íris podem ser visualizados de forma não invasiva e longitudinal por microscopia confocal. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho desta plataforma recém-desenvolvida para imagens in vivo de esferoides hepáticos10. Este protocolo é um guia passo a passo para sua implementação, dividido em (1) a extração de células primárias do fígado de camundongo e a formação in vitro de esferoides hepáticos, (2) o transplante de esferoides hepáticos na ECA de camundongos receptores e (3) a imagem in vivo de esferoides hepáticos enxertados em camundongos anestesiados. Além disso, mostraremos algumas das possibilidades e aplicações desta plataforma de imagem.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais do Karolinska Institutet.

1. Extração de células primárias do fígado de camundongo e geração de esferóides hepáticos in vitro

  1. Preparação
    1. Para a canulação, ressecção hepática e isolamento de células hepáticas primárias, preparar os seguintes materiais estéreis ou de uso único, além de pipetas sorológicas e tubos de centrífuga (figura 1A): bomba peristáltica, centrífuga de balde oscilante, almofada absorvente, tapete de dissecação, duas pinças de ponta curva, tesoura cirúrgica, uma agulha borboleta de 27 G, um filtro de células de 70 μm, um elevador de células, uma placa de Petri de 100 mm, câmara de contagem de células e microplacas de fundo em forma de U de 96 poços.
    2. Prepare as soluções usadas na perfusão hepática, isolamento de células hepáticas primárias e geração de esferóides hepáticos conforme listado na Tabela 1.
      NOTA: O tampão de digestão e a solução de gradiente devem ser preparados frescos.
    3. Configure o sistema de perfusão que consiste em uma bomba peristáltica, que conduz as soluções do banho-maria a 42 ° C para o fígado (Figura 1A). A temperatura mais elevada do banho-maria garante que os tampões cheguem ao fígado à temperatura óptima de 37 °C. Personalize isso dependendo do comprimento do tubo e da temperatura ambiente (RT).
    4. Para a canulação, encaixe uma agulha borboleta de 27 G na extremidade do tubo. Manter os meios de galvanização utilizados nas etapas finais de isolamento a 4 °C.
  2. Procedimento
    1. Pré-aqueça as seguintes soluções no banho-maria a 42 °C em tubos de centrifugação de 50 mL: 40 mL de PBS, 20 mL de tampão de perfusão e 12 mL de tampão de digestão.
    2. Para limpar e aquecer os tubos da bomba, circule aproximadamente 20 mL do PBS pré-aquecido.
    3. Troque o tubo para o tampão de perfusão, prepare o tubo e a agulha borboleta e ajuste a taxa de fluxo para 4 mL / min. Certifique-se de que não haja bolhas na tubulação durante as trocas de buffer em todo o protocolo.
    4. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical e usar agulhas para fixar os membros na placa de dissecação.
    5. Molhe o pelo do abdômen com etanol 70% e disseque-o para acessar os órgãos digestivos.
    6. Mova os intestinos para a direita para expor a veia porta e a veia cava inferior (Figura 1B).
    7. Canule a veia cava aproximadamente na metade de seu comprimento com a agulha na posição horizontal, certifique-se de que esteja estável e ligue a bomba.
    8. Quando o fígado começar a inflar ou pontos brancos aparecerem nos lobos mais próximos, corte a veia porta para permitir que o sangue e o tampão de perfusão sejam drenados.
    9. O fígado deve começar a branquear imediatamente. Incentive a limpeza usando uma pinça curva para pinçar a veia porta em intervalos de 5 s.
    10. Repita a etapa 1.2.9 até que o fígado esteja amarelo e sem sangue (aprox. 15-20 mL de tampão de perfusão).
    11. Pare a bomba peristáltica para trocar a tubulação para o tampão de digestão e reinicie a bomba. Quando o tampão de digestão atingir o fígado, reduza a taxa de fluxo para 2,5 mL / min.
      NOTA: O vermelho de fenol no tampão de digestão permite discriminar sua chegada ao fígado e permite o ajuste dos parâmetros da bomba durante o tratamento.
    12. Para estimular o tampão a atingir todos os lobos hepáticos e garantir uma digestão adequada, repita a etapa 1.2.9 várias vezes.
    13. Pare o fluxo da bomba peristáltica quando o tampão de digestão estiver esgotado ou o fígado parecer suficientemente digerido.
      NOTA: O grau de digestão pode ser monitorado visualmente beliscando suavemente os lóbulos do fígado com uma pinça e verificando se pequenas marcas aparecem no tecido. O fígado também se tornará frágil.
    14. Para extrair o fígado, cortar os ligamentos e conexões hepáticas dentro da cavidade abdominal, com o objetivo de removê-lo completamente, e colocá-lo na placa de Petri contendo 10 mL de meio de plaqueamento frio (Tabela 1).
    15. Depois de remover a vesícula biliar, faça pequenos beliscões nos lóbulos usando uma pinça, rasgando levemente a cápsula hepática. Ao sacudir o fígado no prato, observe as células derramando no meio.
    16. Segurando o fígado firmemente com uma pinça, arraste suavemente o elevador de células ao longo dos lobos para liberar as células.
      NOTA: A digestão interlobular correta levará à suspensão celular na mídia, não a fragmentos de tecido.
    17. Com uma pipeta serológica, recolher a suspensão celular da placa de Petri e filtrar através do filtro de células de 70 μm colocado num tubo de centrifugação de 50 ml. Use meios de revestimento frescos para lavar o prato de células hepáticas digeridas e transferi-las para o filtro.
    18. Centrifugue a 50 x g durante 5 min a 4 °C para peletar as células.
    19. Remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL para cobrir o pellet celular, gire o tubo para ressuspender as células e, em seguida, adicione gradualmente 10 mL de meio de revestimento a frio.
    20. Adicione os 10 mL de solução gradiente à suspensão celular e inverta suavemente o tubo 10 vezes.
    21. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a 4 °C.
    22. O pellet contém células hepáticas viáveis enriquecidas para hepatócitos, enquanto o sobrenadante contém células mortas e detritos. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta sorológica, deixando aproximadamente 1 mL, e ressuspenda o pellet girando suavemente.
    23. Adicione 20 ml de meio de revestimento a frio à suspensão celular e centrifugue a 50 x g durante 5 min a 4 °C para lavar a solução gradiente.
    24. Remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL acima do pellet, e ressuspenda as células em 20 mL de meio de revestimento frio.
      NOTA: Aqui, o pellet celular pode ser compactado, portanto, se necessário, use uma pipeta sorológica de 10 mL para dissociar suavemente as células.
    25. Determine manualmente o número de células e a viabilidade usando uma câmara de contagem de células e Trypan Blue.
      NOTA: As células dos hepatócitos precipitarão rapidamente no tubo; Para ressuspendê-los, inverta suavemente o tubo algumas vezes.
    26. Semeie as células do fígado em 200 μL / poço de meio de plaqueamento a 1200 células / poço em placas de adesão ultrabaixa de 96 poços.
      NOTA: O volume ideal de meio por poço é de 200 μL; no entanto, é possível semear células em 100 μL / poço.
    27. Gire as placas a 200 x g por 3 min para reunir as células no centro dos poços.
    28. Incube (37 ° C, 5% CO2) as células e deixe-as formar esferóides por 5 dias ( Figura 1C ) naturalmente.
    29. No dia 5, remova cuidadosamente metade do meio do poço e substitua-o por meio de manutenção sem soro (Tabela 1). Repita esta etapa a cada 48 h até o dia 10, quando os esferoides hepáticos estão prontos para serem transplantados.
      NOTA: A formação de uma estrutura semelhante a uma cápsula em esferoides hepáticos cultivados mostra boa agregação e viabilidade.

2. Transplante de esferóides hepáticos para a câmara anterior do olho (ECA)

  1. Preparação
    1. Para transplante de esferóides hepáticos para a ECA, certifique-se de providenciar os seguintes recursos (Figura 2A): estereomicroscópio, unidade de anestesia com isoflurano, câmara de indução, isoflurano, almofada de aquecimento, placa de base metálica feita sob medida, suporte de cabeça de mouse e máscara de gás, pinça presa à junta universal sólida, seringa de êmbolo rosqueado Hamilton 500 μL, silicone, polietileno e tubulação de bomba, cânula de vidro rombo feita sob medida ou cateter de 24 G, etanol 70%, soro fisiológico estéril, agulhas estéreis 23 G, pomada ocular (parafina líquida e vaselina na proporção de 1:1), seringa descartável de 1 mL e placa de suspensão celular de 35 mm.
    2. Limpe a seringa, o tubo e a cânula Hamilton passando etanol e solução salina a 70%.
    3. Encha a seringa, o tubo e a cânula de vidro de Hamilton com solução salina e fixe a seringa de Hamilton na bancada na posição horizontal com fita adesiva (Figura 2A).
    4. Use uma cânula de vidro sem corte feita sob medida.
      1. Alongar um capilar de vidro borossilicato usando um extrator de micropipeta de duplo estágio até um diâmetro interno de >300 μm para permitir a aspiração dos esferoides.
      2. Chanfre e embote a ponta usando um chanfrador de microeletrodo e exponha a ponta da cânula a uma chama por alguns segundos para suavizar as bordas.
        NOTA: O chanfrador de microeletrodos consiste em uma pedra de lixa rotativa que é operada manualmente; portanto, configurações específicas não são aplicáveis.
    5. Alternativamente, construa uma cânula usando a parte plástica de um cateter 24 G (Figura 2B).
    6. Prepare a unidade de isoflurano de anestesia e aqueça a almofada de aquecimento a 37 °C.
    7. Cubra as pontas da pinça presa à junta universal sólida com um pedaço de tubo de polietileno para formar um laço, que ajuda a estabilizar o olho.
    8. Transferir os esferóides hepáticos da placa de 96 poços para uma placa de suspensão de células de 35 mm com meios de manutenção utilizando uma pipeta e uma ponta de 200 μL.
  2. Procedimento
    1. Anestesiar o camundongo na câmara de indução usando uma dose de 2,5% de isoflurano e 280 mL / min de ar.
    2. Quando o camundongo estiver inconsciente, abaixe a anestesia para 1,8% de isoflurano e 280 mL / min de ar, conecte o tubo de anestesia ao suporte da cabeça e transfira rapidamente o animal para a almofada de aquecimento, posicionando o nariz dentro do suporte da cabeça.
    3. Imobilize a cabeça com os parafusos, retire suavemente o olho do encaixe e prenda-o com a pinça e coloque uma gota de solução salina em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
    4. Sob o estereoscópio, use a seringa de Hamilton para aspirar e coletar os esferóides hepáticos na ponta da cânula e deixe-os descansar horizontalmente em uma superfície limpa.
      NOTA: A aspiração junto com os esferoides hepáticos ajuda a evitar que eles grudem nas paredes da cânula.
    5. Perfure cuidadosamente a córnea usando uma agulha 23 G e seque o humor aquoso infiltrado com um lenço de papel. Se necessário, para tornar a incisão mais larga, deslize cuidadosamente a agulha para o lado para cortar a córnea.
      NOTA: Uma agulha estéril de uso único é usada para realizar a punção da córnea, para que a córnea não seja desinfetada antes da incisão.
    6. Adicione gotas salinas ao olho para evitar o ressecamento.
    7. Pegue a cânula contendo os esferoides hepáticos e segure-a verticalmente para permitir que os esferoides gravitem em direção à ponta da cânula.
    8. Insira suavemente a cânula no orifício e, com o chanfro direcionado para a pupila, use a seringa de Hamilton para expulsar lentamente os esferoides hepáticos para a ECA (Figura 2C).
      NOTA: Antes de remover a cânula, recomenda-se aguardar alguns segundos para que as pressões do líquido dentro e fora do olho se reajustem e evitem que os esferóides escapem de volta para fora do olho.
    9. De fora da córnea, posicione os esferoides hepáticos ao redor da pupila e longe da incisão, cutucando suavemente a córnea com a ponta da cânula (Figura 2C).
    10. Aguarde ~ 5-10 min para que os esferóides hepáticos se instalem na íris antes de liberar o olho da pinça.
    11. Aplique pomada ocular de vaselina no olho operado, o que ajuda a lubrificar e curar a córnea.
    12. Se desejar, prossiga para operar o segundo olho seguindo o mesmo método.
    13. Antes de acordar o camundongo, administre um analgésico para evitar desconforto pós-operatório, por exemplo, 0,1 mg/kg de buprenorfina em solução salina estéril, administrada por via subcutânea.
      NOTA: Apenas uma dose de analgésicos foi administrada aos camundongos, pois eles se recuperaram rapidamente deste pequeno procedimento e não mostraram sinais de dor ou comportamento alterado. Como esse procedimento é muito rápido (leva menos de 10 minutos) e causa apenas um pequeno desconforto, os camundongos não precisam de cuidados pós-operatórios, além da analgesia pós-operatória administrada antes de acordar o animal.

3. Imagem in vivo de esferóides hepáticos enxertados na ECA

  1. Preparação
    1. Prepare os seguintes materiais e instrumentos para imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na ECA (Figura 3A): microscópio confocal vertical, objetiva de imersão em água de longa distância de trabalho, unidade de anestesia com isoflurano, câmara de indução, isoflurano, almofada de aquecimento, placa de base de metal feita sob medida, suporte de cabeça de camundongo e máscara de gás, pinça presa à junta universal sólida, gel lacrimal artificial, pomada para os olhos (parafina líquida e vaselina na proporção de 1:1).
    2. Os materiais opcionais incluem sondas fluorescentes injetáveis, seringas descartáveis e agulhas 27 G para injeção intravenosa na cauda.
  2. Procedimento
    1. Anestesiar o camundongo na câmara de indução usando uma dose de 2,5% de isoflurano e 280 mL / min de ar.
    2. Quando o camundongo estiver inconsciente, abaixe a anestesia para 1,8% de isoflurano e 280 mL / min de ar, conecte o tubo de anestesia ao suporte da cabeça e transfira rapidamente o animal para a almofada de aquecimento, posicionando o nariz dentro do suporte da cabeça.
    3. Imobilize a cabeça no suporte de cabeça usando os parafusos.
    4. Coloque uma gota de gel lacrimal artificial em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
    5. Neste ponto, injete por via intravenosa sondas fluorescentes através da veia da cauda e obtenha imagens imediatamente depois.
    6. Incline a cabeça, retire suavemente o olho da órbita e prenda-o com uma pinça e coloque-o na posição sob a objetiva.
    7. Aplique uma quantidade generosa de gel lacrimal artificial para preencher o espaço entre a córnea e a objetiva e concentre-se nos esferóides do fígado através da ocular.
      NOTA: Se possível, remova a ocular de uma das oculares para obter uma visão não ampliada e localizar mais facilmente os esferóides na íris.
    8. Para obter imagens de alta resolução, apesar dos movimentos respiratórios do animal, use objetivas de 25x e as seguintes configurações de imagem: formato 512 x 512 pixels, velocidade de varredura de 600 Hz e espessura de pilha Z de 3 μm. Veja as configurações detalhadas de imagem na Tabela 2.
      NOTA: Ao longo da imagem, a concentração da anestesia é ajustada de 1,6-2,2 mL/h de isoflurano para atingir um ritmo respiratório raso e controlado e, assim, minimizar o movimento do animal.
    9. No final da sessão de imagem, trate os olhos fotografados com pomada ocular de vaselina antes de remover o isoflurano e despertar o animal.

Resultados

As células hepáticas primárias, enriquecidas para hepatócitos, foram isoladas do fígado de camundongo por perfusão de colagenase em duas etapas, usando uma bomba peristáltica para circular tampões quentes pelo fígado, aproveitando a vasculatura do órgão para fornecer enzimas de dissociação a todas as células (Figura 1A). Para isso, a veia cava inferior foi canulada e a veia porta foi cortada para permitir o fluxo de tampões (Figura 1B). Primeiro, um tampão à base de HBSS foi liberado através do fígado para limpar o sangue. Se a canulação for bem-sucedida e não houver coágulos sanguíneos, o fígado empalidece e fica amarelo em alguns segundos. Em segundo lugar, um tampão de digestão contendo a mistura de enzimas liberase circulou pelo fígado para dissociar o tecido em uma suspensão unicelular. As células foram contadas manualmente e semeadas em placas de ultrabaixa aderência (ULA) de 96 poços, que permitem a automontagem em esferoides em poucos dias. No dia 5, os esferoides são formados, e a cápsula fina que faz fronteira com os esferoides indica agregação bem-sucedida (Figura 1C). Esperamos até o dia 10 para transplantar, momento em que os esferóides são compactos e desenvolveram fortes conexões célula-célula. O número de células semeadas por poço determinou o tamanho do esferóide hepático, com 1000, 1200 e 1500 células/poço produzindo esferóides de 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm e 298 μm ± 19 μm (média ± DP), respectivamente (Figura 1C, D). Para transplante, selecionamos esferóides de aproximadamente 250 μm de diâmetro pelos seguintes motivos: (1) o tamanho dos esferóides não deve ser muito grande para evitar hipóxia e núcleo necrótico, mas deve conter células suficientes para suportar as comunicações célula-célula e permitir a remodelação do enxerto no olho, (2) o peso dos esferóides desse tamanho permite que eles gravitem em direção à íris e melhorem seu enxerto, (3) Este tamanho é apropriado em relação ao transplante de 5 a 10 esferóides por olho de camundongo.

A cirurgia de transplante requer uma seringa com rosca manual conectada a uma cânula de vidro (Figura 2A). A cânula de vidro consiste em um capilar de vidro borossilicato modificado internamente para ter uma ponta fina e romba usando um extrator de micropipeta e chanfrador. Uma cânula alternativa mais simples pode ser criada usando um cateter plástico disponível comercialmente conectado ao tubo da seringa e estabilizado em uma ponta de pipeta (Figura 2B). A cirurgia consiste na inoculação de esferoides hepáticos na ECA através de uma incisão na córnea (Figura 2C). Os esferoides foram posicionados nas bordas da pupila para torná-los mais acessíveis para imagens e evitar que se movessem para o ângulo ocular. Camundongos albinos foram usados para transplante, pois sua íris não pigmentada permite a imagem in vivo dos esferóides hepáticos enxertados. Os camundongos receptores foram transplantados em ambos os olhos com 7 a 10 esferoides / olho, e imagens estereoscópicas foram tiradas 3 dias após o transplante (pós-Tx), bem como em 1 semana e 1 mês pós-Tx para documentar a cicatrização da córnea e o sucesso do enxerto esferóide ( Figura 2D ). É importante notar que a mudança na aparência dos esferoides hepáticos na ECA entre o momento em que foram recém-transplantados e totalmente enxertados se deve ao assentamento do enxerto na íris, bem como ao crescimento de uma monocamada de células da íris sobre o esferóide. A taxa de sucesso do enxerto de esferoides hepáticos na ECA é de 70% (n = 9 olhos em camundongos machos e fêmeas) (Figura 2E). Os primeiros dias pós-Tx são os mais críticos para a sobrevivência e o enxerto, provavelmente devido ao animal receptor esfregar os olhos e desalojar os esferóides antes que a córnea cicatrize. O tamanho dos esferóides hepáticos não difere significativamente pós-Tx e as alterações na forma são atribuídas à remodelação e enxerto do enxerto (Figura 2F). Aos 1 mês pós-Tx, todos os esferoides enxertados presentes na íris foram vascularizados e inervados, conforme mostrado pela coloração por imunofluorescência (Figura 2G).

A imagem in vivo não invasiva é realizada em camundongos receptores anestesiados usando um microscópio confocal vertical e objetiva de imersão de longa distância (Figura 3A, Tabela 2). A imagem de fluorescência na ECA pode ser obtida por meio de diferentes abordagens, conforme ilustrado na Figura 3B. A injeção de sondas fluorescentes na circulação do camundongo receptor permite a visualização de diferentes tipos de células e estruturas dentro dos esferoides. Usamos lectina para marcar vasos sanguíneos (Figura 3C), CMFDA para observar a rede de canalículos biliares (Figura 3D) e pHrodo-LDL, que confirmou a captação ativa de LDL nas células esferóides (Figura 3E). Esferóides hepáticos gerados a partir de modelos de camundongos repórteres também podem ser usados. Os esferoides de tomate Albumina-Cre:tdTomato permitiram a marcação e rastreamento de hepatócitos (Figura 3F), e esferoides expressando o biossensor Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) foram usados para visualizar a dinâmica do ciclo celular em resolução de célula única (Figura 3G). Finalmente, os esferoides hepáticos podem ser geneticamente modificados in vitro antes do transplante e, no caso da transdução de vírus adeno-associado (AAV)-GFP, a expressão foi observada in vivo por mais de 6 meses (Figura 3H).

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Figura 1: Isolamento de hepatócitos primários de camundongos e geração de esferoides hepáticos. (A) Material e equipamento utilizados para isolamento de hepatócitos primários de camundongos: 1. Tampões de isolamento; 2. Banho-maria; 3. Bomba peristáltica; 4. Placa de Petri; 5. Filtro de células; 6. Almofada absorvente; 7. Tapete de dissecação; 8. Elevador de células; 9. Agulha borboleta 27 G; 10. Ferramentas de dissecação. (B) Cavidade abdominal durante a cirurgia: a veia cava é canulada e perfundida, e a veia porta é cortada para permitir o fluxo dos tampões. (C) Imagens de campo claro da formação de esferóides hepáticos in vitro em 0 (d0), 5 (d5) e 10 (d10) dias após a semeadura, barras de escala = 200 μm. (D) Tamanho do esferóide hepático em diferentes concentrações de semeadura celular, n = 21 esferoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Transplante e enxerto de esferoides hepáticos na ECA de camundongos. (A) Materiais e equipamentos utilizados para transplante (Tx) de esferoides hepáticos na ECA: 1. Esferoides hepáticos em placa de cultura; 2. Solução salina estéril; 3. Pomada para os olhos; 4. Agulhas 23 g; 5. Cânula; 6. Seringa de Hamilton; 7. Tubo de gás de anestesia; 8. Head-holder e máscara de gás; 9. Almofada de aquecimento; 10. Placa de base metálica feita sob medida; 11. Fórceps e junta universal sólida. (B) Configuração da cânula e da seringa Hamilton: 1. Cânula de vidro conectada à seringa Hamilton por meio de tubo Portex e agulha 27G; 2. A cânula de vidro é conectada à tubulação Portex por meio de segmentos adicionais de tubulação de silicone e tubulação PharMed; 3. Cânula plástica montada alternativa; 4. Peças que formam a cânula de plástico: cateter de plástico 24G BD Insyte conectado via tubo PharMed e revestido em uma ponta de pipeta de 10 μl cortada para estabilidade e aderência. (C) Ilustração das etapas da cirurgia Tx: 1. Os esferóides são coletados na cânula; 2. A córnea é perfurada com uma agulha; 3. A cânula é inserida na incisão e os esferóides são liberados na ECA; 4. Do lado de fora do olho, os esferóides são posicionados próximos à pupila e longe da incisão. (D) Imagens estereoscópicas de esferoides hepáticos (sph) no olho do camundongo no dia da cirurgia e aos 3, 7 e 30 dias pós-Tx. As setas indicam esferóides viáveis. (E) Taxa de enxerto de esferóides hepáticos (tamanho de 1200 células/poço) pós-Tx, n= 9 olhos em 6 camundongos receptores. (F) Tamanho dos esferóides hepáticos em cultura, antes do transplante (in vitro, n = 20 esferóides de preparação única) e 1 mês pós-Tx na ECA (in vivo, n = 16 esferóides em 3 camundongos receptores), calculado pela média dos diâmetros vertical e horizontal. (G) Coloração por imunofluorescência de esferoides hepáticos enxertados aos 2 meses pós-Tx, mostrando vascularização (CD31, linha rosa, tracejada delineia a massa esferoide) e inervação simpática (tirosina hidroxilase (TH), laranja), barra de escala = 100 μm. Os dados para o painel F foram adaptados com permissão de Lazzeri-Barcelo et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagem intraocular in vivo não invasiva de esferóides hepáticos enxertados. (A) Material e equipamento usado para imagens ACE in vivo : 1. Microscópio confocal de varredura a laser vertical; 2. Caixa escura; 3. Estágio XYZ motorizado; 4. Objetivo de imersão; 5. Head-holder e máscara de gás; 6. Fórceps e junção universal contínua; 7. Almofada de aquecimento; 8. Placa de base metálica feita sob medida. (B) Diagrama que descreve diferentes abordagens usadas para imagens in vivo de leituras fluorescentes em esferóides hepáticos enxertados no olho. (CH) Imagens representativas de esferóides hepáticos da ECA durante imagens in vivo por microscopia confocal. O sinal de retroespalhamento é usado para observar o volume e a estrutura do esferóide; (C) Vasos sanguíneos marcados por injeção intravenosa de lectina fluorescente, barra de escala = 100 μm; (D) Rede de canalículos biliares marcada por injeção de CMFDA fluorescente, barra de escala = 50 μm; (E) Captação de LDL por injeção de sonda fluorescente pHrodo-LDL, barra de escala = 100 μm; (F) Hepatócitos que expressam Td-Tomato, pontas de seta indicam núcleos e asteriscos indicam vasculatura intra-esferóide, barra de escala = 50 μm; (G) Monitoramento da dinâmica do ciclo celular em esferóides hepáticos que expressam FUCCI, barras de escala = 50 μm (imagem principal) e 20 μm (blow-up). (H) esferóides hepáticos transduzidos in vitro com AAV8-GFP antes de Tx e fotografados no olho 6 meses pós-Tx, barra de escala = 50 μm. A imagem no painel G foi adaptada com permissão de Lazzeri-Barcelo et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Soluções usadas para o isolamento de hepatócitos primários de camundongos. Composição de soluções e tampões necessários para o isolamento de hepatócitos de camundongos. Os componentes do tampão de digestão e da solução gradiente devem ser misturados frescos no dia do isolamento. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2. Configurações de microscópio confocal Leica SP5 usadas para imagens intraoculares in vivo de esferoides hepáticos. A tabela foi adaptada com permissão de Lazzeri et al.10. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Este protocolo descreve uma nova plataforma para imagens intraoculares in vivo de esferoides hepáticos enxertados na ECA. A ECA já foi utilizada anteriormente como local de transplante de outros microtecidos derivados de órgãos, como ilhotas pancreáticas11,12, devido ao seu microambiente de enxerto único, sendo rico em vasos, nervos e oxigênio, e ao acesso a imagens através da córnea. Embora a imagem intravital do fígado permita a visualização de células e processos in situ, o monitoramento longitudinal não é possível. A imagem do fígado através de uma janela abdominal envolve uma cirurgia complexa, e o movimento do órgão dentro do corpo dificulta o rastreamento de uma única célula ao longo do tempo. Portanto, este novo método de imagem permite o monitoramento longitudinal não invasivo das células hepáticas com resolução de célula única.

Este protocolo é dividido em três partes. O primeiro é o isolamento dos hepatócitos primários via perfusão de colagenase em duas etapas, adaptado de Charni-Natan et al.13, com a diferença de que realizamos a perfusão hepática no camundongo morto em vez dos animais vivos anestesiados. Essa variação traz algumas vantagens, como menos considerações éticas e evitar resíduos de anestesia no organismo. Neste trabalho, geramos esferoides hepáticos a partir da fração enriquecida com hepatócitos do isolamento, mas isso não exclui o potencial de isolar outras populações de células não parenquimatosas usando outros protocolos especializados para fazer esferoides de cocultura de composição diversa14,15.

A segunda parte deste protocolo envolve o transplante dos esferoides hepáticos para a ECA de camundongos receptores. Esta é uma cirurgia rápida (menos de 10 min) e simples realizada em camundongos anestesiados e não requer nenhum tratamento pós-operatório. A punção da córnea se auto-sela e cicatriza em 3-5 dias. Ocasionalmente, durante o processo de cicatrização, algum trote é observado ao redor da incisão, mas isso desaparece em poucos dias. Não experimentamos casos de sinéquia anterior nos olhos de animais operados. Realizamos os procedimentos de transplante em um laboratório limpo, mas ao ar livre e sem problemas com infecções nos olhos operados. A inoculação e o enxerto de esferóides no olho não comprometem a visão nem alteram o comportamento do animal receptor. Neste protocolo, usamos anestesia com isoflurano tanto para cirurgia de transplante quanto para imagens in vivo , que é bem tolerada em camundongos. Devido ao seu efeito dose-dependente, pode ser facilmente ajustado ao longo dos procedimentos e traz a vantagem de reduzir os tempos de sono e despertar. No entanto, anestésicos injetáveis alternativos podem ser usados. Após o transplante, geralmente permitimos 1 mês para que os esferoides enxertem totalmente, se tornem vascularizados e inervados, antes de realizar intervenções de tratamento e imagens in vivo . Também mostramos que o transplante e o enxerto são possíveis usando esferoides hepáticos humanos e camundongos receptores imunocomprometidos10.

A terceira parte deste método é a imagem in vivo dos esferóides hepáticos enxertados na ECA. Este protocolo descreve a configuração de imagem in vivo, que usa equipamentos de microscopia comumente encontrados em instalações de imagem de pesquisa. Além disso, os materiais especializados, como o suporte da cabeça do mouse e a cânula de plástico, estão agora disponíveis comercialmente. Com essa configuração de imagem, somos capazes de capturar seções em z e obter uma reconstrução tridimensional da arquitetura esferoide, dependendo da profundidade de penetração do laser e da detecção de fluorescência. O monitoramento da função celular nos esferoides hepáticos enxertados depende da visualização de proteínas fluorescentes que relatam tipos de células, funções celulares e dinâmica. Assim, esta plataforma de imagem pode ser explorada usando diferentes modalidades, isoladamente ou em combinação: (1) Sondas fluorescentes podem ser administradas por via intravenosa, por exemplo, anticorpos para marcar e rastrear células, bem como corantes funcionais; (2) Os esferoides hepáticos podem ser gerados a partir de células isoladas de modelos de camundongos repórteres que expressam proteínas fluorescentes específicas do fígado, por exemplo, esferoides hepáticos FUCCI que relatam a dinâmica do ciclo celular; (3) A formação de esferoides hepáticos in vitro pode ser combinada com transfecção ou transdução, para equipar os esferoides com proteínas fluorescentes e biossensores. por exemplo, vírus adeno-associados. Em nossas configurações experimentais e usando um único fóton para excitação, a profundidade de imagem possível é de aproximadamente 60-100 μm. No entanto, isso depende da potência do laser e da disponibilidade de imagens multifotônicas, das características de emissão da sonda de fluorescência e da sensibilidade dos detectores, bem como do ângulo do olho no qual o esferóide é enxertado. Após a aquisição da imagem, a análise de imagem downstream pode ser realizada usando programas populares como Image J e Imaris. Por exemplo, no caso do repórter FUCCI, as células ativas do ciclo celular em verde podem ser contadas e contrastadas com o número total de glóbulos vermelhos para avaliar a atividade do ciclo celular dentro do esferóide enxertado. Além disso, a plataforma de imagem ACE permite que substâncias sejam aplicadas no olho (na forma de colírios) ou injetadas diretamente no ACE para tratar o enxerto e monitorar sua reação. Post-mortem, os esferoides transplantados podem ser facilmente recuperados por microdissecção manual e podem fornecer informações valiosas por técnicas ex vivo, como coloração por imunofluorescência, análise transcriptômica, etc.10.

Esta técnica tem certas limitações. A primeira é que, pela nossa experiência, os camundongos receptores devem ser albinos, ou seja, ter íris não pigmentada. Após o enxerto, os esferóides do fígado ficam cobertos por uma monocamada de células da íris, o que não afeta a viabilidade ou função dos esferoides, mas o pigmento nas células da íris impede a imagem. Uma segunda consideração é a estabilidade durante a imagem intraocular em camundongos anestesiados. Durante as sessões de imagem in vivo , a concentração da anestesia e a respiração do animal devem ser monitoradas de perto para minimizar o movimento. No entanto, usando as configurações de imagem indicadas aqui, somos capazes de obter imagens de alta resolução no nível de uma única célula.

Para resumir, este protocolo descreve a implementação de uma plataforma de imagem in vivo não invasiva de tecido semelhante ao fígado enxertado nos olhos de camundongos. Usamos procedimentos fáceis, equipamentos comuns e materiais acessíveis, tornando-se uma abordagem acessível para muitos investigadores. Este modelo combina as vantagens dos esferoides hepáticos 3D in vitro com o ambiente in vivo e a acessibilidade óptica fornecida pelo ACE para criar uma plataforma valiosa para estudar a fisiologia e patologia hepática em pesquisa básica e ambientes pré-clínicos.

Divulgações

P-OB é o cofundador e CEO da Biocrine AB, IBL e BL são consultores da Biocrine AB.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Associação Sueca de Diabetes, Fundos do Karolinska Institutet, Conselho Sueco de Pesquisa, Fundação Novo Nordisk, Fundação Família Erling-Persson, Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes do Karolinska Institutet, Fundação Família Knut e Alice Wallenberg, Fundação Jonas & Christina af Jochnick, Associação Sueca de Diabetologia e ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. Os desenhos das figuras foram criados pela FL-B usando BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha borboleta 27 GVenofix4056388
AAV8-CAG-GFPCharles RiverCV17169-AV9Incubado com hepatócitos isolados a 1 µ L/mL durante a formação do esferóide hepático
Absoluto e 70%de etanol N/AN/A
Absorvente AbsorventeAtende203903
Albumina-Cre; RCL-tdTomate (B6. Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J; B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)Jackson#003574 e #007914Camundongos obtidos de
camundongos albinos B6 reprodutores internos (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)Jackson#000058Camundongos obtidos de reprodução interna
B6; 129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknHINFRAFRONTIER/EMMAEM:08395Camundongos obtidos de reprodução interna
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 inBD Medical381212
Cápsulas de vidro padrão borosicadas World Precision Instruments1B150-4
Elevador de célulasCorning3008
Filtro de células, 70 µ mFalcon352350
Placa de metal feita sob medidaLoja de ferragensN / A
DexametasonaSigma-AldrichD4902
Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágioNarshigeModelo PC-100
EDTASigma-AldrichE9884
Almofada de aquecimento elétricoLoja de ferragensN / A
FBSGibcoN/A
GlutaMAXGibco35050061
Verde CMFDAAbcamab145459Reconstituído em DMSO, administrado a 100 µ g/mouse em seringa PBS 10% FBS
Hamilton SeringaHamilton81242, 500 µ L
HBSS; sem cálcio, sem magnésio e sem vermelho de fenolGibco14175095
HCX IRAPO L 25x/0,95 W objetivaLeicaN/A
HEPESGibco15630080
Câmara de indução 0,8 LUniventor8329001
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS-G)Gibco41400045
IsofluranoBaxterN/A
Lectin DyLight-649InvitrogenL32472Administrado a 1 mg/mL e 100 µ L / mouse
Liberase TM Grau de PesquisaSigma-Aldrich5401127001
Microeletrodo chanfradorWorld Precision InstrumentsModelo BV-10
Suporte de cabeça de mouse e máscara de gásNarshigeModelo SGM-4
Nunclon Sphera 96 poços, microplaca de fundo em forma de UThermo Fisher174929
Oculentum simplexAPLN/A
PBS 10xGibco14080055
PBS 1x; sem cálcio, sem magnésioGibco14190144
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140122
Percoll Bomba peristálticaSigma-AldrichP1644
IsmatecModelo ISM795
PharMed BPT Bomba TubingVWRVERN070540-07Diâmetro interno 0,76 mm, diâmetro externo 2,46 mm
pHrodo Red-LDLInvitrogenL34356Administrado a 1 mg/mL e 100 µ Tubo
Polietileno de Furo Fino Portex para LSmiths Medical800/100/140Diâmetro interno 0,4 mm, diâmetro externo 0,8 mm
Tapete de dissecação de siliconeLoja de ferragensN/A
Cloreto de sódio 0,9%BraunN/A
Junta Universal SólidaNarshigeModelo UST-2
EstereomicroscópioLeicaModelo M80
Placa de cultura em suspensão 35 mmSarstedt833900500
TemgesicIndivorN/AAdministrado s.c. a 0,05 mg/mL e 2 µ Tubo
Silicone TranslúcidoVWR228-1450Diâmetro interno 1,5 mm, diâmetro externo 3 mm
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
Univentor 400Univentor8323001
Microscópio confocal de varredura a laser verticalLeicaModelo TCS SP5 II
ViscotearsNovartisN/A
William's E Medium; sem glutamina, vermelho de fenolGibco22551089
de Êmbolo Rosqueado com Ponta Luer Modelo 1750 de /mouse de L/g mouse Unidade de anestesia

Referências

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  15. Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).

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