A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .
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Artigo de método
Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os parasitoides de ovos, Trichogramma spp, são reconhecidos como eficientes agentes de controle biológico contra diversas pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro, exibindo notável diminuividade (aproximadamente 0,5 mm de comprimento adulto). A metodologia de RNA-interferência (RNAi) tem emergido como uma ferramenta crucial para elucidar funções gênicas em inúmeros organismos. No entanto, a manipulação de RNAi em certas espécies de pequenos parasitoides, como Trichogramma, tem geralmente representado desafios significativos. Neste estudo, apresentamos um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. O procedimento delineado abrange a aquisição e o isolamento de espécimes individuais de T. dendrolimi a partir de ovos hospedeiros, o planejamento e a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), o transplante e cultivo in vitro de pupas de T. dendrolimi , a microinjeção de dsRNA e a subsequente avaliação do knockdown do gene alvo através da análise de RT-qPCR. Este estudo fornece um procedimento abrangente e visualmente detalhado para a realização de experimentos de RNAi em T. dendrolimi, permitindo que os pesquisadores investiguem a regulação gênica nesta espécie. Além disso, esta metodologia é adaptável para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma com pequenos ajustes, tornando-se uma referência valiosa para a realização de experimentos de RNAi em outras espécies endoparasitárias.
Introdução
Trichogramma spp é um grupo de parasitoides de ovos que tem sido extensivamente utilizado como agentes de controle biológico altamente eficientes contra um amplo espectro de lepidópteros pragas em ecossistemas agrícolas e florestais em todo o mundo 1,2,3,4. A aplicação de Trichogramma criado em massa proporciona uma abordagem ambientalmente correta para o manejo sustentável de pragas 5,6,7. A compreensão da biologia molecular de ve....
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos, software e reagentes usados neste protocolo.
1. Coleta e manutenção da cultura de insetos
- Aderir um grupo de ~5.000 ovos de Corcyra cephalonica (Stainton) em um cartão de 9 cm por 16 cm usando uma solução 1:5 (v/v) de goma arábica em pó e água25,26.
NOTA: Evite anexar muitos ovos de anfitrião ao cartão, pois a superlotação torna impraticável para procedimentos subsequentes de transferência e dissecação. - Para evita....
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Resultados
A taxa de emergência de pupas de T. denrolimi injetadas com dsFerhch foi significativamente menor do que a daquelas injetadas com dsGFP ou sem injeção (Tabela 1). Entre as vespas emergidas, 51,85% das vespas T. denrolimi submetidas a dsFerhch desenvolveram pequenas asas deformadas. As vespas deformadas não foram observadas nas vespas injetadas com dsGFP ou sem qualquer injeção (Tabela 1). Além disso, o abdome de pupas de T. denrol.......
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Discussão
As vespas Trichogramma são reconhecidas como agentes eficazes de controle biológico, visando especificamente uma variedade de pragas de lepidópteros na agricultura e silvicultura1. Essas vespas diminutas passam por seus estágios imaturos dentro do ovo hospedeiro, característica que apresenta desafios na condução de experimentos com RNAi 5,18. Este estudo oferece um guia visual abrangente para a realização de experimentos de RNAi e.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelos Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32172476, 32102275), pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e pelos Fundos Centrais Orientando o Desenvolvimento Científico e Tecnológico Local (XZ202301YD0042C).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | Para amplificar as sequências de dsRNA |
| 20x PBS Buffer, tratado com DEPC (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | Para diluir a tira de ágar dsRNA |
| Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, China | n/a | Para fazer meio de cultura | |
| Ampicilina sódica | Sangon Biotech, China | A610028 | Fazer meio de cultura |
| Bioer Banho de metal de temperatura constante | BIOER, China | MB-102 | Para síntese de dsRNA |
| Borosilicato capilar de vidro | WPI, USA | 1B100-4 | Para puxar agulha de vidro capilar |
| Bancada limpa | Airtech, China | SW-CJ-1FD | Para extrair RNA |
| Dupla água destilada | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | Para diluir cDNA |
| Câmara de Teste Ambiental | Panasonic, Japão | MLR-352H-PC | Para cultura T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Alemanha | 5418R | Para armazenar conteúdo de RNA |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Alemanha | FemtoJet 4i | Para injetar T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifugador Refrigerado | Eppendrof, Alemanha | 5810R | centrífuga |
| (75%, sem RNase) | Aladdin, China | M052131-500ml | de RNA |
| Omega, EUA | D25000-02 | Para extrair | |
| a goma de | Solarbio, China | CG5991-500g | Para fazer cartão de ovo |
| Álcool isopropílico | Aladdin, China | 80109218 | Para extrair RNA |
| Extrator de Micropipetas Baseado em Laser | SUTTER, USA | P-2000 | Para puxar agulha de vidro capilar |
| Microloader | Eppendrof, Alemanha | 20 µ L | Para carregar dsRNA |
| Triturador de tecidos com várias amostras | LICHEN, China | LC-TG-24 | Para moer T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, EUA | BV-10-E | Para moer agulha de vidro capilar |
| Água Livre de Nuclease | Sangon Biotech, China | Para diluir RNA | |
| OLYMPUS Microscópio | OLYMPUS, Japão | XZX16 | Para observar a máquina de PCR T. denrolimi |
| Bio-rad, EUA | S-1000 | Para amplificação de DNA | |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | Para detectar a qualidade do dsRNA |
| Primer de dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
| Primer de dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
| Primer de Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer de Ferhch for qPCR ( Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer de Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
| Primer de Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
| Primer de FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer de FoxO para qPCR (Reverso) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit com gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japão | RR047A | |
| PCR quantitativo em tempo real | Bio-rad, EUA | CFX 96 Touch | Para realizar a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) |
| de Design de Primer e Sondas de PCR em Tempo Real (TaqMan) | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | Para síntese de dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) | TaKaRa, Japão | RR820A | Para realizar RT-qPCR |
| Triclorometano | KESHI, China | GB/T682-2002 | Para extrair RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, EUA | 15596018 | Para extrair conteúdo total de RNA de amostras |
| Congelador de temperatura ultrabaixa | Thermo, EUA | Forma 911 |
Referências
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al.
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Reimpressões e permissões
