Kweek van Axenic Delia antiqua met halfgefermenteerde steriele diëten
Summary
Er wordt een eenvoudige procedure beschreven voor het kweken van axenische Delia antiqua met halfgefermenteerde steriele diëten. Met behulp van PCR werd slechts één Wolbachia-stam gedetecteerd in elke instar van axenische D. antiqua .
Abstract
Axenische insecten worden verkregen uit steriele kunstmatige kweeksystemen met behulp van steriele media. Deze insecten, gekenmerkt door hun kleine formaat, korte groeicyclus en lage voedingsbehoefte, zijn ideaal voor het bestuderen van de relatie tussen micro-organismen en gastheren. De darmmicrobiota heeft een aanzienlijke invloed op de fysiologische kenmerken van insectengastheren, en het introduceren van specifieke stammen in axenische insecten biedt een methode om de microbiële functies van de darm te verifiëren. Delia antiqua, een bedreigende plaag in de orde Diptera, familie Anthomyiidae en geslacht Delia, voedt zich voornamelijk met uien, knoflook, prei en andere groenten van de familie Liliaceae. De larven voeden zich met de bollen en veroorzaken rotting, verwelking en zelfs de dood van hele planten. Door axenische larven te kweken, kunnen vervolgstudies worden uitgevoerd om de effecten van darmmicroflora op de groei en ontwikkeling van D. antiqua te observeren. In tegenstelling tot de methode waarbij antibiotica geassocieerde microben elimineren, presenteert dit artikel een goedkope en zeer efficiënte benadering voor het kweken van axenische D. antiqua. Na oppervlaktesterilisatie van D. antiqua-eieren , werden halfgefermenteerde steriele diëten gebruikt om larven groot te brengen, en de axenische toestand van D. antiqua werd geverifieerd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke tests. Kortom, de combinatie van sterilisatie van insecteneieren en de bereiding van steriele diëten voor larvale cultuur heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van een efficiënte en eenvoudige methode voor het verkrijgen van axenische D. antiqua. Deze methode biedt een krachtige benadering voor het bestuderen van interacties tussen insecten en microflora.
Introduction
Axenische dieren, gedefinieerd als dieren waarin geen levensvatbare micro-organismen of parasieten kunnen worden gedetecteerd, zijn waardevolle experimentele modellen voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en micro-organisme 1,2. Insecten, de grootste groep ongewervelde dieren, kunnen symbiotische relaties aangaan met micro-organismen. Axenische insecten kunnen worden gebruikt om gastheer-symbiontinteracties in symbiotische systemen te bestuderen4. Nishide et al.5 hebben bijvoorbeeld een praktische steriele kweekprocedure voor de onwelriekende worm Plautia stali vastgesteld, waardoor een betrouwbare en rigoureuze analyse van gastheer-symbionteninteracties in modelsymbiotische systemen mogelijk wordt. Axenische insecten kunnen worden geproduceerd door het eistadium te steriliseren en steriel voedsel te geven aan de larven en volwassenen 6,7. Axenische insecten zijn van groot belang en worden veel gebruikt in biologisch onderzoek. Een studie uitgevoerd door Somerville et al.8 toonde bijvoorbeeld aan dat diamantrugmotten die waren ingeënt met Enterobacter cloacae het aanpassingsvermogen van transgene mannetjes verbeterden.
Delia antiqua Meigen is een economisch belangrijke plaag voor uien en andere Liliaceae-gewassen wereldwijd, waarbij de larven de bollen van uien en andere Liliaceae-gewassen beschadigen9. D. antiqua komt voornamelijk voor in gematigde klimaten en is wijdverbreid in uienteeltgebieden van Noord- en Zuid-Amerika, Europa en Azië. Als het niet goed wordt bestreden, kan het leiden tot oogstverliezen bij uien (Allium cepa L.), knoflook (Allium sativum L.), sjalotten (Allium fistulosum L.) en prei (Alliumchoenoprasum L.), variërend van 50% tot 100%10,11. De larven voeden zich met de ondergrondse delen van planten, en deze voeding zorgt ervoor dat de zaailingen verwelken en uiteindelijk sterven. Bovendien kunnen beschadigde planten ziekteverwekkers binnenlaten, wat leidt tot bolrot12. Zelfs als de planten niet volledig door de larven worden geconsumeerd, maakt de schade die ze veroorzaken de uienplanten onverkoopbaar en resulteert dit in economische verliezen.
Insecten zijn nauw verbonden met de darmmicrobiota en de meeste insectendarmen bevatten een verscheidenheid aan symbiotische bacteriën die gedijen op de voedingsstoffen die door de gastheer worden geleverd 13,14. Jing et al.15 toonden aan dat de primaire functie van de intestinale symbiotische gemeenschap het leveren van essentiële voedingsstoffen is, gevolgd door functies die verband houden met spijsvertering en ontgifting. In bepaalde gevallen kunnen darmbacteriën dienen als microbiële hulpbron voor ongediertebestrijding. Daarom is het wenselijk om de prestaties en specifieke functies van de individuele darmbacteriën in het lichaam van D. antiqua te bestuderen. Daarom is het prepareren van axenische larven bijzonder belangrijk voor het bestuderen van de interacties tussen specifieke bacteriestammen en insecten16. Momenteel is een veelgebruikte methode om insectendarmbacteriën te elimineren het gebruik van een antibioticacombinatie om geassocieerde microben uit te roeien 17,18,19. In tegenstelling tot het gebruik van antibiotica alleen, die alleen het aantal microben kunnen verminderen, maakt axenische kweek van insecten controle mogelijk over de samenstelling en hoeveelheid micro-organismen, waardoor een nauwkeurigere validatie van de functionaliteit van de darmmicrobiota mogelijk wordt.
Daarom introduceert dit artikel een protocol voor het bereiden en kweken van axenische D. antiqua. Axenisch larvale voedsel wordt verkregen door gebruik te maken van sterilisatie op hoge temperatuur van natuurlijke diëten in combinatie met half gefermenteerd voedsel. De eieren worden gesteriliseerd volgens een experimenteel protocol om axenische eieren te verkrijgen, en ten slotte worden axenische larven gekweekt uit de axenische eieren. Het axenische kweeksysteem werd voor het experiment slechts voor één generatie uitgevoerd. Dit biedt gemak voor het bestuderen van de interactie tussen insecten en darmmicrobiota.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insecten bezitten een zeer complexe darmmicrobiota20,21, waardoor het gebruik van axenische insecten die zijn geïnoculeerd met specifieke darmmicrobiële stammen noodzakelijk is voor het bestuderen van interacties tussen insecten en micro-organismen. De bereiding van axenische insecten is cruciaal voor dergelijke onderzoeksinspanningen. Antibioticabehandeling is een methode die wordt gebruikt om de darmmicrobiota te elimineren. Jung en Kim22</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32272530), het New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in de provincie Shandong (2021TZXD002) en het Science and Education Integration Project van Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referências
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
