גידול אקסני Delia antiqua עם דיאטות סטריליות מותססות למחצה
Summary
מתואר הליך פשוט לגידול אנטיקווה דליה אקסנית עם דיאטות סטריליות מותססות למחצה. רק זן וולבכיה אחד זוהה בכל כוכב של אקסני D. antiqua באמצעות PCR.
Abstract
חרקים אקסניים מתקבלים ממערכות גידול מלאכותיות סטריליות באמצעות מדיה סטרילית. חרקים אלה, המאופיינים בגודלם הקטן, מחזור הגידול הקצר שלהם ודרישות המזון הנמוכות שלהם, אידיאליים לחקר הקשר בין מיקרואורגניזמים לפונדקאים. מיקרוביוטת המעיים משפיעה באופן משמעותי על המאפיינים הפיזיולוגיים של פונדקאי החרקים, והחדרת זנים ספציפיים לחרקים אקסניים מספקת שיטה לאימות תפקודי חיידקי המעי. דליה אנטיקווה (Delia antiqua), מזיק מאיים ממשפחת הדיפטרה, משפחת האנתומיים (Anthomyiidae) והסוג דליה (Delia), ניזון בעיקר מבצל, שום, כרישה וירקות אחרים ממשפחת השושנים. הזחלים שלו ניזונים מהפקעות וגורמים לריקבון, נבילה ואפילו מוות של צמחים שלמים. על ידי גידול זחלים אקסניים, ניתן לערוך מחקרי מעקב כדי לבחון את ההשפעות של microflora במעיים על הצמיחה וההתפתחות של D. antiqua. בניגוד לשיטה הכרוכה בסילוק אנטיביוטיקה של חיידקים קשורים, מאמר זה מציג גישה בעלות נמוכה וביעילות גבוהה להעלאת D. antiqua אקסני. לאחר עיקור פני השטח של ביצי D. antiqua , נעשה שימוש בתזונה סטרילית מותססת למחצה לגידול זחלים, והמצב האקסני של D. antiqua אומת באמצעות בדיקות תלויות תרבית ובלתי תלויות תרבות. לסיכום, השילוב של עיקור ביצי חרקים והכנת תזונה סטרילית לתרבית זחלים איפשר פיתוח שיטה יעילה ופשוטה לקבלת D. antiqua אקסני. שיטה זו מספקת גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חרקים-מיקרופלורה.
Introduction
בעלי חיים אקסניים, המוגדרים כבעלי חיים שבהם לא ניתן לזהות מיקרואורגניזמים או טפילים בני קיימא, הם מודלים ניסיוניים רבי ערך לחקר אינטראקציות בין פונדקאי למיקרואורגניזם 1,2. חרקים, הקבוצה הגדולה ביותר של חסרי חוליות, יכולים ליצור יחסים סימביוטיים עם מיקרואורגניזמים3. חרקים אקסניים יכולים לשמש לחקר אינטראקציות פונדקאי-סימביונט במערכות סימביוטיות4. לדוגמה, Nishide et al.5 ביססו הליך גידול סטרילי מעשי עבור תולעת הריח הרע Plautia stali, המאפשר ניתוח אמין וקפדני של אינטראקציות סימביוטיות-מארח במערכות סימביוטיות מודל. חרקים אקסניים יכולים להיווצר על ידי עיקור שלב הביצה ומתן מזון סטרילי לזחלים ולמבוגרים 6,7. חרקים אקסניים הם בעלי חשיבות רבה והם נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. לדוגמה, מחקר שנערך על ידי Somerville et al.8 הראה כי עש היהלומים שחוסנו בגלימת Enterobacter שיפרו את יכולת ההסתגלות של זכרים טרנסגניים.
דליה אנטיקווה מייגן הוא מזיק חשוב מבחינה כלכלית של בצל וגידולים אחרים של שושנים ברחבי העולם, כאשר הזחלים שלו פוגעים בפקעות הבצל ובגידולים אחרים של שושנים9. D. antiqua מצוי בעיקר באקלים ממוזג והוא נפוץ באזורי גידול בצל באמריקה, אירופה ואסיה. אם אינו נשלט כראוי, הוא עלול לגרום לאובדן יבולים בבצל (Allium cepa L.), שום (Allium sativum L.), שאלוט (Allium fistulosum L.) וכרישה (Alliumchoenoprasum L.) בטווח של 50% עד 100%10,11. הזחלים ניזונים מהחלקים שמתחת לפני הקרקע של הצמחים, והאכלה זו גורמת לשתילים לנבול ולבסוף למות. בנוסף, צמחים פגומים יכולים לאפשר לפתוגנים להיכנס, מה שמוביל לנורה נרקבת12. גם אם הצמחים אינם נצרכים לחלוטין על ידי הזחלים, הנזק שהם גורמים הופך את צמחי הבצל לבלתי סחירים וגורם להפסדים כלכליים.
חרקים קשורים קשר הדוק למיקרוביוטה של המעי, ורוב מעי החרקים מכילים מגוון חיידקים סימביוטיים שמשגשגים על חומרי המזון שמספק הפונדקאי13,14. Jing et al.15 הראו כי התפקיד העיקרי של הקהילה הסימביוטית של המעי הוא לספק חומרים מזינים חיוניים, ולאחר מכן פונקציות הקשורות לעיכול וניקוי רעלים. במקרים מסוימים, חיידקי המעיים יכולים לשמש כמשאב מיקרוביאלי למטרות הדברת מזיקים. כתוצאה מכך, רצוי לחקור את הביצועים של חיידקי המעיים הבודדים ואת תפקודיהם הספציפיים בגוף של D. antiqua. לכן, הכנת זחלים אקסניים חשובה במיוחד לחקר יחסי הגומלין בין זני חיידקים ספציפיים לבין חרקים16. כיום, שיטה נפוצה לסילוק חיידקי מעיים של חרקים היא שימוש בשילוב אנטיביוטי כדי לחסל את המיקרובים הקשורים 17,18,19. בניגוד לשימוש באנטיביוטיקה בלבד, שיכולה רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים, גידול אקסני של חרקים מאפשר שליטה על הרכב וכמות המיקרואורגניזמים, מה שמאפשר אימות מדויק יותר של תפקוד מיקרוביוטת המעי.
לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת וגידול אקסני D. antiqua. מזון זחל אקסני מתקבל על ידי שימוש בעיקור בטמפרטורה גבוהה של דיאטות טבעיות בשילוב עם מזונות מותססים למחצה. הביצים מעוקרות בעקבות פרוטוקול ניסיוני לקבלת ביצים אקסניות, ולבסוף, זחלים אקסניים מתורבתים מהביצים האקסניות. מערכת הגידול האקסנית בוצעה במשך דור אחד בלבד לצורך הניסוי. זה יספק נוחות לחקר האינטראקציה בין חרקים למיקרוביוטה של המעיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לחרקים יש מיקרוביוטת מעייםמורכבת מאוד 20,21, מה שמחייב שימוש בחרקים אקסניים המחוסנים בזני מעיים ספציפיים לחקר אינטראקציות בין חרקים למיקרואורגניזמים. הכנת חרקים אקסניים חיונית למאמצי מחקר כאלה. טיפול אנטיביוטי הוא שיטה המשמשת לסילוק המיקרוביוטה של המעי. לד…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32272530), עשרים המדיניות החדשה לפרויקט האוניברסיטה בג’ינאן (2021GXRC040), פרויקטים גדולים של חדשנות מדעית וטכנולוגית במחוז שאנדונג (2021TZXD002), ופרויקט שילוב המדע והחינוך של אוניברסיטת Qilu לטכנולוגיה (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referências
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
