Oppdrett av aksenisk delia antiqua med halvfermenterte sterile dietter
Summary
En enkel prosedyre for oppdrett av aksenisk Delia antiqua med halvfermenterte sterile dietter er beskrevet. Bare en Wolbachia-stamme ble påvist i hver stjerne av aksenisk D. antiqua ved bruk av PCR.
Abstract
Akseniske insekter er hentet fra sterile kunstige oppdrettssystemer ved bruk av sterile medier. Disse insektene, preget av sin lille størrelse, korte vekstsyklus og lave fôrbehov, er ideelle for å studere forholdet mellom mikroorganismer og verter. Tarmmikrobiota påvirker signifikant de fysiologiske egenskapene til insektverter, og innføring av spesifikke stammer i akseniske insekter gir en metode for å verifisere tarmmikrobielle funksjoner. Delia antiqua, et truende i ordenen Diptera, familie Anthomyiidae og slekten Delia, lever primært av løk, hvitløk, purre og andre grønnsaker i familien Liliaceae. Larvene spiser på pærene, forårsaker rotting, visning og til og med død av hele planter. Ved oppdrett av akseniske larver kan oppfølgingsstudier utføres for å observere effekten av intestinal mikroflora på vekst og utvikling av D. antiqua. I motsetning til metoden som involverer antibiotikaeliminering av tilknyttede mikrober, presenterer denne artikkelen en billig og høyeffektiv tilnærming til å heve aksenisk D. antiqua. Etter overflatesterilisering av D. antiqua egg ble halvfermenterte sterile dietter brukt til å heve larver, og aksenisk tilstand av D. antiqua ble verifisert gjennom kulturavhengige og kulturuavhengige analyser. Avslutningsvis har kombinasjonen av insekteggsterilisering og fremstilling av sterile dietter for larvalkultur muliggjort utviklingen av en effektiv og enkel metode for å oppnå aksenisk D. antiqua. Denne metoden gir en kraftig tilnærming til å studere insekt-mikroflora-interaksjoner.
Introduction
Akseniske dyr, definert som dyr der ingen levedyktige mikroorganismer eller parasitter kan påvises, er verdifulle eksperimentelle modeller for å studere vertsmikroorganismeinteraksjoner 1,2. Insekter, den største gruppen av virvelløse dyr, kan danne symbiotiske forhold med mikroorganismer3. Akseniske insekter kan brukes til å studere vertssymbiontinteraksjoner i symbiotiske systemer4. For eksempel etablerte Nishide et al.5 en praktisk steril oppdrettsprosedyre for malodorormen Plautia stali, som muliggjorde pålitelig og streng analyse av vertssymbiontinteraksjoner i modellsymbiotiske systemer. Akseniske insekter kan produseres ved å sterilisere eggstadiet og gi steril mat til larver og voksne 6,7. Akseniske insekter er av stor betydning og er mye brukt i biologisk forskning. For eksempel viste en studie utført av Somerville et al.8 at diamondback møll inokulert med Enterobacter cloacae forbedret tilpasningsevnen til transgene hanner.
Delia antiqua Meigen er et økonomisk viktig på løk og andre Liliaceae-avlinger over hele verden, med larver som skader løkløkene og andre Liliaceae-avlinger9. D. antiqua finnes hovedsakelig i tempererte klimaer og er utbredt i løkdyrkingsområder i Amerika, Europa og Asia. Hvis det ikke kontrolleres riktig, kan det forårsake avlingstap i løk (Allium cepa L.), hvitløk (Allium sativum L.), sjalottløk (Allium fistulosum L.) og purre (Alliumchoenoprasum L.) fra 50% til 100%10,11. Larvene spiser på de underjordiske delene av planter, og denne fôringen får plantene til å visne og til slutt dø. I tillegg kan skadede planter tillate patogener å komme inn, noe som fører til pærerotting12. Selv om plantene ikke blir fullstendig fortært av larvene, gjør skaden de forårsaker løkplantene usalgbare og resulterer i økonomiske tap.
Insekter er nært forbundet med tarmmikrobiota, og de fleste insekttarmer inneholder en rekke symbiotiske bakterier som trives på næringsstoffene fra verten13,14. Jing et al.15 viste at den primære funksjonen til det intestinale symbiotiske samfunnet er å gi essensielle næringsstoffer, etterfulgt av funksjoner knyttet til fordøyelse og avgiftning. I visse tilfeller kan tarmbakterier tjene som en mikrobiell ressurs for skadedyrsbekjempelse. Følgelig er det ønskelig å studere de enkelte tarmbakterienes ytelser og spesifikke funksjoner i kroppen av D. antiqua. Derfor er fremstilling av akseniske larver spesielt viktig for å studere samspillet mellom spesifikke bakteriestammer og insekter16. For tiden er en vanlig metode for å eliminere insekttarmbakterier bruk av en antibiotikakombinasjon for å utrydde tilknyttede mikrober 17,18,19. I motsetning til bruk av antibiotika alene, som bare kan redusere mikrobielle tall, tillater aksenisk oppdrett av insekter kontroll over sammensetningen og mengden av mikroorganismer, noe som muliggjør mer nøyaktig validering av tarmmikrobiota-funksjonalitet.
Dermed introduserer denne artikkelen en protokoll for å forberede og oppdrette aksenisk D. antiqua. Axenisk larvemat oppnås ved å benytte høytemperatursterilisering av naturlige dietter kombinert med halvfermenterte matvarer. Eggene steriliseres etter en eksperimentell protokoll for å oppnå akseniske egg, og til slutt dyrkes akseniske larver fra akseniske egg. Det akseniske oppdrettssystemet ble utført i bare en generasjon for forsøket. Dette vil gi bekvemmelighet for å studere samspillet mellom insekter og tarmmikrobiota.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insekter har en svært kompleks tarmmikrobiota20,21, noe som nødvendiggjør bruk av akseniske insekter inokulert med spesifikke tarmmikrobielle stammer for å studere insekt-mikroorganismeinteraksjoner. Utarbeidelsen av akseniske insekter er avgjørende for slike forskningsbestrebelser. Antibiotisk behandling er en metode som brukes til å eliminere tarmmikrobiota. For eksempel matet Jung og Kim22 Spodoptera exigua med penicillin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (32272530), New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2021TZXD002), og Science and Education Integration Project of Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referências
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
