Ensaio de Aspiração por Micropipeta de Fluorescência para Investigar Mecanosensing de Hemácias

Resumo

A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.

Resumo

Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.

Introdução

Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos ^1,2.

Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo ....

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.

1. Isolamento de hemácias humanas

OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.

1. Retirar 5 ml de sangue da veia cubital mediana utilizando uma agulha de borboleta de 19 G.
2. Transferir o sangue coletado para um tubo de 15 mL contendo 1:200 enoxaparina para evitar a coagulação.
3. Diluir 5....

Resultados

Para estabelecer ensaios de aspiração por micropipeta, construímos primeiramente uma câmara celular personalizada composta por dois quadrados metálicos (cobre/alumínio) conectados por uma alça. Duas lamínulas de vidro de terceiro corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) foram afixadas para criar uma câmara preenchida com 200 μL de hemácias suspensas no tampão de Tyrode. Depois de introduzir hemácias na câmara, uma micropipeta de borossilicato sob medida foi fixada em um suporte e cuidadosamente posicionada dentro da câmara usando .......

Discussão

Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou uma exploração m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
µ Seringa Manager	Micro-Manager		Versão 2.0.0
1 mL	Terumo	210320D	Coopere com a Microfil
200 µ L Pipeta	Eppendorf	3123000055	Preparação de célula de clood vermelho
22 x 40 mm Lamínulas de Vidro	Tricô	MS0014	Montagem da câmara celular
Seringa de 50 mL	Terumo	220617E	Conecte à torre de água
Cloreto de Cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Preparação de tampão de Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Centrífuga 5425	Eppendorf	5405000280	Preparação de células de clood vermelho
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	Para evitar a coagulação do sangue coletado. 10.000 U/mL
DAQami	Diligent
Fonte de luz de fluorescência	CoolLED	pE-300	Sistema de hardware de aspiração de micropipeta
Capilar de vidro	Narishige	G-1	Fabricação
Preparação	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7,2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  preparação do tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glicose suplementados com 1 mM de CaCl2. pH final = 7.2
Câmera GigE de alta velocidade	Manta	G-040B	Sistema de hardware de aspiração de micropipeta
Grampo de pressão de alta velocidade	Instrumento Científico	HSPC-2-SB	Coopere com a bomba de pressão Cabeça de
grampo de pressão de alta velocidade estágio	Instrumento Científico	HSPC-2-SB	Coopere com a bomba de pressão
Imaris	Oxford Instruments
Microscopia Invertida	Olympus	Sistema de hardware de aspiração de micropipeta	Olympus IX83
Microfil	Instrumentos de Precisão Mundiais	MF34G-5	34 G (67 mm de comprimento) Retire a bolha de ar na micropipeta cortada e teste a abertura da ponta da pipeta
Extrator de Micropipetas	Instrumento Sutter	P1000	Micropipeta fabric
Milli Q EQ 7000 Sistema de purificação de água ultrapura	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Tampão de carbonato/bicarbonato e Pipeta de preparação de tampão Tryode
microforge	Narishige	MF-900	Micropipeta fabrica
Cloreto de Potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparação de tampão Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Bomba de Pressão	Instrumento Científico	PV-PUMP	Induza pressão controlada durante o experimento
Câmera Prime 95B	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Imagem fluorescente
Unidade remota de roda rotativa	Sensapex	Painel de controle uM-RM3	para ajuste de posição da micropipeta
Contador de células portátil Scepter 3.0	Merck Millipore	PHCC340KIT	Contador automático de células
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparação de tampão carbonato/bicarbonato - 2,65 g de NaHCO3 com 2,1 g de Na2CO3 em 250 mL de água Mili Q - pH final = 8-9.
Carbonato de sódio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparação de tampão carbonato/bicarbonato - 2,65 g de NaHCO3 com 2,1 g de Na2CO3 em 250 mL de água Mili Q - pH final = 8-9.
Cloreto de Sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  preparação de tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7,2
Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  preparação de tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glicose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Unidade de controle de tela sensível ao toque	Sensapex	uM-TSC	Painel de controle para ajuste da posição da micropipeta
X seco Objetivo	Olympus	de hardware de aspiração de micropipeta	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL

de de micropipetas de tampão de Glucose Sistema