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Artigo de método

Ensaio de Aspiração por Micropipeta de Fluorescência para Investigar Mecanosensing de Hemácias

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DOI:

10.3791/66265

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12 de janeiro de 2024

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1School of Biomedical Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4The University of Sydney Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney

Neste artigo

Resumo

A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.

Resumo

Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.

Introdução

Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos 1,2.

Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo de diversas respostas celulares a estímulos mecânicos. Esta técnica oferece informações valiosas sobre as propriedades mecânicas intrínsecas de células vivas em nível de célula única, incluindo módulo elástico celular, rigidez e tensão cortical. Esses ensaios permitem a mensuração de vários parâmetros mecânicos, como tensão da membrana celular, pressão exercida sobre a membrana celular e tensão cortical (resumidos na Tabela 1). O estudo das forças aspiracionais enriqueceu nossa compreensão de como elas influenciam as funções e os processos celulares, particularmente no âmbito da dinâmica da membrana, incluindo fragmentação, alongamento e brotamento 3,4.

Parâmetro mecânicoDescriçãoAbordagens seminais
Rigidez CelularMedição da rigidez mecânica e elasticidade de uma célula.Aspiração da membrana celular e análise da resposta da deformação à pressão negativa20,21.
Força de AdesãoAvaliação da aderência das células às superfícies.Aplicação de sucção controlada para desprender as células aderidas de um substrato2,22.
Tensão da membranaAvaliação da tensão ou estresse dentro das membranas celulares.Medida da deformação da membrana em resposta à pressão aplicada23,24.
Propriedades viscoelásticasCaracterização do comportamento viscoso e elástico combinado de uma célula.Análise da resposta tempo-dependente da deformação à aspiração23,25.
DeformabilidadeDeterminação da facilidade com que uma célula pode mudar de forma.Avaliação da extensão da deformação sob sucção controlada20,24.
Tensão superficialMedição da tensão na superfície da célula.Avaliação da pressão necessária para formar uma protrusão da membrana da micropipeta26.
Interação Célula-MaterialEstudo de interações entre células e materiais ou substratos.Aspiração de células em contato com diferentes materiais e observação de interações2,24.
Interação célula-célulaExame de interações entre células vizinhas.Aspiração de um grupo de células e análise de suas forças intercelulares27.

Tabela 1: Parâmetros mecânicos caracterizados pelo ensaio de aspiração por micropipeta.

A técnica de aspiração por micropipeta tem sido amplamente utilizada no estudo das hemácias, avaliando a deformabilidade e as diversas características mecânicas das hemácias, o que é essencial para o entendimento de sua função no sistema circulatório. As hemácias apresentam notável adaptabilidade, preservando sua versatilidade mecânica contra deformações ao navegar pela intrincada rede capilar e fendas interendoteliais 5,6. Durante esse trajeto, as hemácias devem atravessar passagens tão estreitas quanto 0,5-1,0 μm, sujeitando-se a uma infinidade de forças mecânicas, incluindo tensão e compressão 7,8,9. Também apresentam alta sensibilidade ao estresse de cisalhamento gerado pelo fluxo sanguíneo durante a circulação10. Esses processos promovem a ativação de mecanismos regulatórios envolvendo o influxo de cálcio, um evento sinalizador crucial com papéis bem estabelecidos nas respostas celulares a estímulos mecânicos11,12. Os complexos mecanismos que governam a mecanosensing mediada por cálcio permanecem como temas de investigação em andamento.

Nesse contexto, o fMPA apresenta-se como uma abordagem eficaz para revelar a extensão da mobilização de cálcio sob forças mecânicas precisamente controladas, permitindo a aplicação simultânea de modulação mecânica (usando o sistema de aspiração de micropipetas) e visualização da intensidade de cálcio (usando indicadores fluorescentes). Ele imita particularmente o cenário fisiológico quando o eritrócito viaja através do estreitamento dos vasos sanguíneos. Vale ressaltar que o sistema fMPA que desenvolvemos pode gerar pressão com resolução de 1 mmHg. A câmera de alta velocidade implementada pode alcançar uma resolução temporal de 100 ms e uma resolução espacial no nível de submícrons. Essas configurações garantem a aplicação precisa de forças mecânicas às células vivas e, simultaneamente, capturam a sinalização celular resultante. Além disso, devido à natureza de engenharia integrativa deste setup, o ensaio de aspiração de micropipetas pode ser prontamente adaptado para complementar outros equipamentos ou técnicas, permitindo uma maior exploração dos meandros da mecânica celular. Essa versatilidade é uma vantagem adicional dessa abordagem.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.

1. Isolamento de hemácias humanas

OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.

  1. Retirar 5 ml de sangue da veia cubital mediana utilizando uma agulha de borboleta de 19 G.
  2. Transferir o sangue coletado para um tubo de 15 mL contendo 1:200 enoxaparina para evitar a coagulação.
  3. Diluir 5 μL de sangue anticoagulado com enoxaparina em 1 mL de tampão carbonato/bicarbonato (tampão C, pH = 8,5-9; Tabela de Materiais).
  4. Centrifugar a amostra de sangue diluído a 900 × g por 1 min para sedimentar as hemácias. Decantar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
  5. Realizar duas lavagens do pellet de hemácias com 1 mL de tampão C (Tabela de Materiais), centrifugando cada vez a 900 × g por 1 min.
  6. Em seguida, lavar o pellet de RBC 2x com 1 mL de tampão de Tyrode usando as mesmas condições de centrifugação e, em seguida, ressuspender o pellet final em 1 mL de tampão de Tyrode para obter a suspensão de RBC de caldo lavado.

2. Carregamento do indicador de cálcio

  1. Ajustar a concentração da solução de hemácias de material lavado para 10 × 106 células/mL no tampão de Tyrode, com base na contagem de células obtida usando um contador automático de células (Tabela de Materiais).
  2. Rotular o cálcio dentro das hemácias incubando com 16,67 μM Cal-520 AM, um corante sensível ao cálcio, enquanto agita em um misturador de tubo rotativo por 1 h.
  3. Diluir as hemácias em tampão Tyrode contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) na proporção de 1:50. As células estão agora prontas para uso experimental.

3. Fabricação de micropipetas

  1. Monte o tubo capilar de vidro borossilicato (1 mm de diâmetro externo x 0,6 mm de diâmetro interno) no extrator de micropipeta P-1000 para produzir duas micropipetas correspondentes com pontas fechadas no local de tração usando o programa de tração predefinido. Para essa configuração, use os seguintes valores de programa de tração: calor 516, tração 150, velocidade 75, tempo 250 e pressão 500.
    NOTA: Os parâmetros de aquecimento e tração definidos no programa de tração podem ser personalizados e dependem das configurações desejadas do planejamento experimental12. CHECKPOINT (ver Tabela Suplementar S1).
  2. Abra a ponta fechada montando uma das micropipetas fechadas obtidas após puxar o cortador de micropipetas. Ajuste a temperatura de aquecimento para aproximadamente 50-60 °C.
  3. Localize a micropipeta usando uma ocular de 10x. Mova a micropipeta para perto do talão de vidro borossilicato usando os botões para ajuste.
  4. Mude a ocular para 30x antes de posicionar a micropipeta o mais próximo possível do talão de vidro borossilicato sem dobrar a ponta da pipeta.
  5. Suavize o talão de vidro borossilicato usando calor pisando no pedal de aquecimento. Insira suavemente a ponta da micropipeta fechada crua no talão amolecido até que o ponto final desejado, o diâmetro de abertura, tenha sido atingido.
  6. Solte o pedal e deixe o talão de vidro esfriar. Certifique-se de que a ponta da micropipeta permaneça sempre dentro do talão.
    NOTA: Inserir a ponta ainda leva a maiores diâmetros de abertura.
  7. Extraia suavemente a micropipeta, levando a um corte reto claro na micropipeta fechada. Confirme se o diâmetro final do capilar é de 1 μm.
    NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1)

4. Preparação da câmara celular

  1. Use um lápis de diamante para dividir uma tampa de vidro padrão de 40 mm x 22 mm x 0,17 mm em três tiras iguais.
  2. Adera um pedaço da tampa de vidro cortada ao fundo de um suporte de câmara caseiro com graxa a vácuo.
    NOTA: O suporte da câmara é composto por dois quadrados de metal (cobre/alumínio) que estão ligados por uma alça curva. A distância entre os blocos metálicos deve ser inferior a 40 mm para que a lamínula cortada grude no suporte forme uma câmara paralela.
  3. Adera a segunda peça da tampa de vidro cortada à parte superior do suporte de câmara caseiro com graxa a vácuo.
    NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1)
  4. Injetar 200 μL da suspensão de hemácias marcadas entre duas lamínulas usando uma pistola de pipeta de 200 μL (Figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: Ilustração da câmara celular. Duas peças cortadas de uma tampa de vidro de 40 mm x 22 mm x 0,17 mm são aderidas ao suporte da câmara usando graxa. Entre as duas lamínulas de vidro cortadas, aproximadamente 200 μL da solução celular no tampão de Tyrode é semeado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Conjunto de aspiração da micropipeta

  1. Monte a câmara celular no estágio do suporte presente na plataforma do microscópio. Ajuste a posição para que a câmara celular fique diretamente acima da objetiva (Figura 2B).
  2. Abaixe o suporte da micropipeta para abaixo do nível de fluido do reservatório de água conectado.
  3. Injete água desmineralizada ou tampão de Tyrode na micropipeta fabricada e remova cuidadosamente todas as bolhas de ar usando uma seringa acoplada a uma agulha de 34 G (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Desparafuse a extremidade do suporte da micropipeta até a metade e deixe a água escorrer do suporte da micropipeta por alguns segundos.
    NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1)
  5. Insira a micropipeta na ponta do suporte. Aperte o parafuso do suporte para garantir que a micropipeta seja fixada.
  6. Insira a micropipeta na câmara celular e localize a micropipeta e as hemácias sob o microscópio. Use o micromanipulador para ajustar a posição.
  7. Abaixe ainda mais a ponta da micropipeta para garantir que a ponta esteja nivelada com o RBC localizado.
    NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1)
  8. Zere a pressão hidráulica na ponta da micropipeta ajustando a altura do reservatório de água. Em seguida, eleve levemente o reservatório de água para gerar uma pressão positiva sutil na ponta.

6. Realizar o ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência

  1. Ligue a fonte de luz de excitação fluorescente de 488 nm. Não ligue o obturador de fluorescência nesta fase para evitar o fotoclareamento (Figura 2C). Ligue a câmera de fluorescência e a câmera transmitida.
    NOTA: Ambas as câmeras são operadas usando o software apropriado (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Definir o tempo de exposição desejado (100 ms para ambas as câmeras neste estudo), região de interesse (ROI), tamanho do binning (nenhum para este estudo) para ambas as câmeras no software. Abra o painel de aquisição multidimensional para configurar o número do quadro de aquisição, 2.000 para este estudo, e o diretório de salvamento.
    Observação : o número de quadro de aquisição é dependente do número desejado de eventos de aspiração que devem ser registrados. Para 1 evento de aspiração, o intervalo do número de aquisição deve ser definido dentro de 100-500, que é de aproximadamente 10-50 s.
  3. Encontre a micropipeta sob o campo de visão usando o micromanipulador.
  4. Ligue a pinça de pressão pneumática, incluindo a caixa de controle e o sistema de fixação (Figura 2A). Verifique se a caixa de controle está no modo EXTRNL. Compense qualquer pressão de deslocamento dentro do sistema girando lentamente o botão.
  5. Ligue o software separado que controla a braçadeira pneumática. O software possui um painel de controle elétrico para controlar a entrada analógica discreta para o sistema de grampo. A pressão é controlada com um fator de conversão de 20 mV/mmHg.
  6. Zerar a pressão dentro do sistema. Ajuste cuidadosamente a micropipeta perto das hemácias. Ajuste a posição do reservatório de água até que uma pressão positiva sutil seja notada na ponta da micropipeta.
  7. Inicie a aquisição no software operacional da câmera. Ligue o obturador de fluorescência.
  8. Aspirar um RBC digitando a magnitude da tensão calculada no painel de controle para atingir a pressão desejada.
    NOTA: A pressão para aspirar um eritrocitário está tipicamente na faixa de Δp = -5 a -40 mmHg. Deve haver um alongamento de língua perceptível dentro da ponta da micropipeta (Figura 2D).
  9. Segure a pressão por um período predefinido; Em seguida, libere a pressão.
  10. Mova a micropipeta para pegar a próxima célula e repita o experimento.

7. Análise da intensidade da fluorescência

  1. Carregue as imagens de fluorescência salvas no software de análise.
  2. Ajuste o limite de intensidade usando a guia de ajuste de exibição . Faça isso inserindo manualmente os valores ou usando o controle deslizante para garantir que as imagens de fluorescência mostrem um contraste claro da célula no software de análise (consulte Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1).
  3. Role até a linha do tempo na parte inferior do software. Localize o evento de aspiração designado.
  4. Clique em Adicionar novas superfícies. Defina o ROI da análise.
    NOTA: O software fornece um processo guiado de cinco etapas para ajustar e concluir a segmentação (consulte Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3).
    NOTA: Mantenha o ROI o menor possível para economizar recursos computacionais.
  5. Use o controle deslizante de subtração em segundo plano e ajuste o limite de segmentação usando o controle deslizante para obter o melhor resultado de segmentação.
    NOTA: Isso significa que, além do evento de aspiração, o plano de fundo deve ser segmentado com a maior precisão possível (consulte Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S4 e Figura Suplementar S5).
  6. Adicione um filtro de área para excluir ruídos de fundo (consulte Arquivo suplementar 1-Figura suplementar S6).
    Observação : isso é concluído no estágio de pós-processo.
  7. Selecione a guia estatísticas | guia detalhada | guia Valores médios . Role para localizar e selecionar a média de intensidade (consulte Arquivo Suplementar 1 – Figura Suplementar S7).
  8. Exporte o rastreamento de sinal de fluorescência ao longo do tempo para um arquivo .csv.
  9. Abra o arquivo csv exportado. Subtrair os sinais de fundo, Fb, de todas as medições.
  10. Calcular a variação da intensidade do cálcio, ΔFmáx, usando a equação (1):
    figure-protocol-2(1º)
    Onde ΔFmax é a mudança máxima da intensidade de cálcio, Fb é a intensidade de fundo e F0 é a intensidade de repouso.

figure-protocol-3
Figura 2: Conjunto de aspiração de micropipetas acopladas a fluorescência. (A) Uma visão geral do sistema de hardware fMPA incorporando o microscópio invertido combinado com as câmeras de campo brilhante e fluorescência. O lado esquerdo da imagem mostra o manômetro de água caseiro e a caixa de controle que permite ajustar com precisão a pressão da bomba de pressão pneumática. (B) A etapa do microscópio representando a câmara celular do experimento e o sistema micromanipulador com uma única micropipeta. (C) Esquema da configuração do sistema fMPA. Imagem simultânea de sinais de campo brilhante (amarelo) e fluorescência (emissão azul, excitação verde) utilizando dois espelhos dicroicos para direcionar os caminhos da luz da fonte de luz de fluorescência (azul) para o alvo, em seguida, para as câmeras para aquisição de imagens (verde). (D) A linha superior representa as imagens de campo brilhante, enquanto a linha inferior demonstra as imagens de fluorescência. A esquerda representa a posição da micropipeta antes da aspiração quando o CH está em repouso. A coluna do meio retrata o processo de aspiração onde o eritrocitário experimenta uma pressão negativa de -40 mmHg. A direita representa a morfologia celular após experimentar a pressão negativa de aspiração. Barra de escala = 5 μm. Abreviações: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipeette Aspiration; DM = espelho dicroico; Hematácias = hemácias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Para estabelecer ensaios de aspiração por micropipeta, construímos primeiramente uma câmara celular personalizada composta por dois quadrados metálicos (cobre/alumínio) conectados por uma alça. Duas lamínulas de vidro de terceiro corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) foram afixadas para criar uma câmara preenchida com 200 μL de hemácias suspensas no tampão de Tyrode. Depois de introduzir hemácias na câmara, uma micropipeta de borossilicato sob medida foi fixada em um suporte e cuidadosamente posicionada dentro da câmara usando ...

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Discussão

Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou uma exploração m...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses conflitantes a relatar em relação ao presente estudo.

Agradecimentos

Agradecemos a Nurul Aisha Zainal Abidin e Laura Moldovan pelo recrutamento adicional de doadores, coleta de sangue e apoio à flebotomia. Agradecemos a Tomas Anderson e Arian Nasser pela organização dos equipamentos e reagentes. Esta pesquisa foi financiada pelo Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); o National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Concessão de Equipamentos NHMRC-L.A.J.; NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Bolsa de Pesquisador em Início de Carreira-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI Bolsa de Inovação em Pesquisa; Escritório de Engajamento Global e de Pesquisa (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. é membro da National Heart Foundation Future Leader Fellow Nível 2 (105863) e bolsista da Snow Medical Research Foundation (2022SF176).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
µ Seringa ManagerMicro-ManagerVersão 2.0.0
1 mL Terumo210320DCoopere com a Microfil 
200 µ L Pipeta Eppendorf 3123000055Preparação de célula de clood vermelho
22 x 40 mm Lamínulas de VidroTricôMS0014Montagem da câmara celular
Seringa de 50 mL Terumo220617EConecte à torre de água
Cloreto de Cálcio (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Preparação de tampão de Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Centrífuga 5425Eppendorf 5405000280Preparação de células de clood vermelho
ClexaneSigma-Aldrich1235820Para evitar a coagulação do sangue coletado. 10.000 U/mL
DAQamiDiligent
Fonte de luz de fluorescênciaCoolLEDpE-300Sistema de hardware de aspiração de micropipeta
Capilar de vidroNarishigeG-1Fabricação
PreparaçãoSigma-AldrichG8270Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7,2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  preparação do tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glicose suplementados com 1 mM de CaCl2. pH final = 7.2
Câmera GigE de alta velocidadeMantaG-040BSistema de hardware de aspiração de micropipeta
Grampo de pressão de alta velocidadeInstrumento CientíficoHSPC-2-SBCoopere com a bomba de pressão Cabeça de
grampo de pressão de alta velocidade estágio Instrumento CientíficoHSPC-2-SBCoopere com a bomba de pressão
ImarisOxford Instruments
Microscopia Invertida Olympus Sistema de hardware de aspiração de micropipetaOlympus IX83
Microfil Instrumentos de Precisão MundiaisMF34G-534 G (67 mm de comprimento)
Retire a bolha de ar na micropipeta cortada e teste a abertura da ponta da pipeta 
Extrator de Micropipetas Instrumento SutterP1000Micropipeta fabric 
Milli Q EQ 7000 Sistema de purificação de água ultrapuraMerck MilliporeZEQ7000T0CTampão de carbonato/bicarbonato e Pipeta de preparação de tampão Tryode
microforge NarishigeMF-900Micropipeta fabrica
Cloreto de Potássio (KCl)Sigma-AldrichP9541Preparação de tampão Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Bomba de Pressão Instrumento CientíficoPV-PUMPInduza pressão controlada durante o experimento
Câmera Prime 95BPhotometricsPrime 95B sCMOSImagem fluorescente
Unidade remota de roda rotativa Sensapex Painel de controle uM-RM3para ajuste de posição da micropipeta 
Contador de células portátil Scepter 3.0Merck MilliporePHCC340KITContador automático de células
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Preparação de tampão carbonato/bicarbonato - 2,65 g de NaHCO3 com 2,1 g de Na2CO3 em 250 mL de água Mili Q - pH final = 8-9.
Carbonato de sódio (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparação de tampão carbonato/bicarbonato - 2,65 g de NaHCO3 com 2,1 g de Na2CO3 em 250 mL de água Mili Q - pH final = 8-9.
Cloreto de Sódio (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's  preparação de tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, e 5.5 mM D-glucose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7,2
Fosfato de Sódio Monobásico
Monohidratado (NaH2PO4 • H2O)		Sigma-AldrichS9638Tryode's  preparação de tampão - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glicose suplementados com 1 mM CaCl2. pH final = 7.2
Unidade de controle de tela sensível ao toque Sensapex uM-TSCPainel de controle para ajuste da posição da micropipeta 
X seco Objetivo Olympus de hardware de aspiração de micropipetaOlympus 60x/0.70 LUCPlanFL
de de micropipetas de tampão de Glucose Sistema

Referências

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