JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

Modellering af ligander til kort afledt af elektronkryomikroskopi

Published: July 19, 2024
doi:
10.3791/66310
, ,
1National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

Denne protokol introducerer de tilgængelige værktøjer til modellering af småmolekyleligander i cryoEM-kort over makromolekyler.

Abstract

Dechifrering af protein-ligand-interaktionerne i et makromolekylært kompleks er afgørende for at forstå den molekylære mekanisme, underliggende biologiske processer og lægemiddeludvikling. I de senere år er kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket op som en kraftfuld teknik til at bestemme makromolekylers strukturer og til at undersøge ligandbindingstilstanden ved næsten atomar opløsning. Identifikation og modellering af ikke-proteinmolekyler i cryoEM-kort er ofte udfordrende på grund af anisotropisk opløsning på tværs af molekylet af interesse og iboende støj i dataene. I denne artikel introduceres læserne til forskellige software og metoder, der i øjeblikket bruges til ligandidentifikation, modelopbygning og forfining af atomare koordinater ved hjælp af udvalgte makromolekyler. En af de enkleste måder at identificere tilstedeværelsen af en ligand på, som illustreret med enolase-enzymet, er at trække de to kort opnået med og uden liganden. Den ekstra tæthed af liganden vil sandsynligvis skille sig ud i forskelskortet selv ved en højere tærskel. Der er tilfælde, som vist i tilfældet med metabotrop glutamatreceptor mGlu5, hvor sådanne simple forskelskort ikke kan genereres. Den nyligt introducerede metode til at udlede Fo-Fc udeladelseskortet kan tjene som et værktøj til at validere og demonstrere tilstedeværelsen af liganden. Endelig, ved hjælp af den velundersøgte β-galactosidase som eksempel, analyseres effekten af opløsning på modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i cryoEM-kort, og et syn på, hvordan cryoEM kan bruges til lægemiddelopdagelse, præsenteres.

Introduction

Celler udfører deres funktioner ved at udføre utallige kemiske reaktioner samtidigt og uafhængigt, hver omhyggeligt reguleret for at sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som reaktion på miljømæssige signaler. Dette opnås ved molekylær genkendelse, som gør det muligt for biomolekyler, især proteiner, at danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler såvel som små molekyler eller ligander1. Således er protein-ligand-interaktioner grundlæggende for alle processer i biologien, som omfatter regulering af proteinekspression og aktivitet, enzymers genkendelse af substrater og cofaktorer, samt hvordan celler opfatter og videresender signaler 1,2. En bedre forståelse af de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskaber af protein-ligand-komplekset afslører det molekylære grundlag for ligandinteraktion og letter også rationelt lægemiddeldesign ved at optimere lægemiddelinteraktion og specificitet. En økonomisk og hurtigere tilgang til at studere protein-ligand-interaktion er at bruge molekylær docking, som er en beregningsmetode, der virtuelt screener en bred vifte af små molekyler og forudsiger bindingstilstanden og affiniteten af disse ligander til målproteiner3. Imidlertid giver eksperimentelle beviser fra højopløselige strukturer bestemt ved røntgendiffraktion (XRD), kernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det væsentlige bevis for sådanne forudsigelser og hjælper med udviklingen af nyere og mere effektive aktivatorer eller hæmmere for et givet mål. Denne artikel bruger forkortelsen ‘cryoEM’, som teknikken almindeligvis omtales. Der er dog en igangværende debat om valg af den korrekte nomenklatur, og for nylig er udtrykket kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blevet foreslået for at indikere, at prøven er ved kryogen temperatur og afbilledet med elektroner4. På samme måde er kortene afledt af cryoEM blevet kaldt elektronpotentiale, elektrostatisk potentiale eller Coulomb-potentiale, og for nemheds skyld bruger vi her cryoEM-kort 5,6,7,8,9,10.

Selvom XRD har været guldstandardteknikken til højopløsningsstrukturbestemmelse af protein-ligandkomplekser, har11 cryoEM efter opløsningsrevolution taget fart, som indikeret af stigningen i Coulomb-potentialekort eller kryoEM-kort deponeret i Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 i løbet af de sidste par år14. På grund af fremskridt inden for prøveforberedelse, billeddannelse og databehandlingsmetoder steg antallet af Protein Data Bank (PDB)14-aflejringer, der anvender cryoEM, fra 0,7 % til 17 % mellem 2010 og 2020, hvor ca. 50 % af de rapporterede strukturer i 2020 blev bestemt ved 3,5 Å opløsning eller bedre15,16. CryoEM er hurtigt blevet vedtaget af det strukturelle biologiske samfund, herunder medicinalindustrien, da det tillader undersøgelse af fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, især membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved næsten atomar opløsning, overvinde krystallisationsprocessen og opnå veldiffrakterende krystaller, der kræves til højopløsningsstrukturbestemmelse ved XRD.

Nøjagtig modellering af liganden i cryoEM-kortet er altafgørende, da det fungerer som en plan for protein-ligandkomplekset på molekylært niveau. Der er flere automatiserede ligandbygningsværktøjer, der bruges i røntgenkrystallografi, der afhænger af formen og topologien af ligandtætheden for at passe eller bygge liganden ind i elektrontætheden 17,18,19,20. Ikke desto mindre, hvis opløsningen er lavere end 3 Å, har disse tilgange en tendens til at give mindre ønskværdige resultater, fordi de topologiske træk, som de er afhængige af for at blive anerkendt og opbygget, bliver mindre definerede. I mange tilfælde har disse metoder vist sig at være ineffektive til nøjagtig modellering af ligander til kryoEM-kort, da disse kort er blevet bestemt i området lav til medium opløsning, typisk mellem 3,5 Å-5 Å17.

Det første trin i 3D-strukturbestemmelse af et protein-ligandkompleks ved cryoEM involverer enten samoprensning af liganden med proteinet (når liganden har en høj bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering af proteinopløsningen med liganden i en bestemt varighed før gitterforberedelse. Efterfølgende placeres et lille prøvevolumen på et plasmarenset hullet TEM-gitter, efterfulgt af flashfrysning i flydende ethan og til sidst billeddannelse med en kryo-TEM. 2D-projektionsbillederne fra hundredtusinder til millioner af individuelle partikler er gennemsnittet for at rekonstruere et 3-dimensionelt (3D) Coulomb-potentialekort over makromolekylet. Identifikation og modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i disse kort udgør betydelige udfordringer i mange tilfælde på grund af den anisotrope opløsning på tværs af kortet (dvs. opløsningen er ikke ensartet på tværs af makromolekylet), fleksibilitet i det område, hvor liganden er bundet, og støjen i dataene. Mange af de modellerings-, forfinings- og visualiseringsværktøjer, der blev udviklet til XRD, bliver nu tilpasset til brug i cryoEM til samme formål 18,19,20,21. I denne artikel præsenteres en oversigt over forskellige metoder og software, der i øjeblikket bruges til at identificere ligander, bygge modeller og forfine koordinaterne afledt af cryoEM. En trin-for-trin protokol er blevet leveret for at illustrere de processer, der er involveret i modellering af ligander ved hjælp af specifikke protein-ligandkomplekser med varierende opløsning og kompleksitet.

Det første trin i modellering af ligander i cryoEM-kort inkluderer identifikation af ligandtætheden (ikke-protein) i kortet. Hvis ligandbinding ikke inducerer nogen konformationsændring i proteinet, så fremhæver beregning af et simpelt forskelskort mellem protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i det væsentlige regionerne med ekstra tæthed, hvilket tyder på tilstedeværelsen af liganden. Sådanne forskelle kan observeres med det samme, da det kun kræver to kort, og selv mellemliggende kort under 3D-forfiningsprocessen kan bruges til at kontrollere, om liganden er til stede. Derudover, hvis opløsningen er høj nok (<3,0 Å), kan forskelskortet også give indsigt i placeringen af vandmolekyler såvel som ioner, der interagerer med liganden og proteinresterne.

I mangel af apo-protein-kortet er det nu muligt at bruge Servalcat22, som er tilgængeligt som et selvstændigt værktøj og også er blevet integreret i CCP-EM-softwarepakken23,24 som en del af Refmac-forfiningen og i CCP4 8.0 version25,26. Servalcat tillader beregning af et FSC-vægtet forskelskort (Fo-Fc) ved hjælp af de uskarpe halvafbildninger og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc udeladelseskortet repræsenterer forskellen mellem det eksperimentelle kort (Fo) og det kort, der er afledt af modellen (Fc). I mangel af en ligand i modellen antyder en positiv tæthed i et Fo-Fc-kort, der overlapper med det eksperimentelle EM-kort, typisk tilstedeværelsen af liganden. Antagelsen her er, at proteinkæden passer godt ind på kortet, og den resterende positive tæthed angiver ligandens placering. Det er dog vigtigt omhyggeligt at undersøge, om den positive tæthed stammer fra modelleringsunøjagtigheder, såsom den forkerte rotamer af en proteinsidekæde.

Det andet trin involverer opnåelse eller oprettelse af en kartesisk koordinatfil af liganden med veldefineret geometri fra den tilgængelige kemiske information. Standardligander (f.eks. ATP og NADP+), der allerede er tilgængelige i CCP4-monomerbiblioteket, kan bruges til forfining ved at hente koordinat- og geometrifilerne via deres monomertiltrædelseskode. For ukendte eller ikke-standardiserede ligander er der dog forskellige værktøjer til rådighed til at oprette geometrifilerne. Nogle af eksemplerne omfatter eLBOW27 – (elektronisk ligandbygger og optimeringsarbejdsbord) i Phoenix28, Lidia – et indbygget værktøj i Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-et modul af Glide i Schrödinger-pakken. Ligandkoordinatfilen monteres derefter i tætheden, styret af både det eksperimentelle kryoEM-kort og differenskortet i Coot. Dette efterfølges af forfining i det virkelige rum i Phoenix28 eller gensidig forfining i Refmac33. En Linux-arbejdsstation eller en bærbar computer udstyret med et godt grafikkort og ovennævnte software er påkrævet. De fleste af disse programmer er inkluderet i forskellige suiter. CCP-EM24 og Phenix28 er frit tilgængelige for akademiske brugere og inkluderer en række værktøjer, der bruges i denne artikel, herunder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine osv. På samme måde giver Chimera37 og ChimeraX38 gratis licenser til akademiske brugere.

Protocol

1. Modellering af phosphoenolpyruvat (PEP) i enolase fra Mycobacterium tuberculosis Identifikation af ligandtæthed i kryoEM-kortet over PEP-enolase-kompleksetDownload de uskarpe halvkort (emd_30988_additional_1.map og emd_30988_additional_2.map) af apo-enolase fra de yderligere data i EMDB (se materialefortegnelsen). Åbn ChimeraX (se materialefortegnelsen). Åbn halvkortene af apo-enolase ved at klikke på Åbn fra…

Representative Results

Eksempel 1Enzymet enolase fra M. tuberculosis katalyserer det næstsidste trin i glykolyse og omdanner 2-phosphoglycerat til phosphoenolpyruvat (PEP), som er et essentielt mellemprodukt for flere metaboliske veje44,45. CryoEM-data for apo-enolase- og PEP-bundne enolase-prøver blev indsamlet ved samme pixelstørrelse på 1,07 Å, og billedbehandling blev udført med Relion 3,146,47…

Discussion

Forbedringerne i mikroskophardware og -software har resulteret i en stigning i antallet af cryoEM-strukturer i de senere år. Selvom den højeste opløsning, der opnås i øjeblikket i enkeltpartikelkryoEM, er 1,2 Å 57,58,59, bestemmes størstedelen af strukturerne omkring 3-4 Å opløsning. Modellering af ligander i kort med medium til lav opløsning kan være vanskelig og ofte fyldt med tvetydighed. I betragtning af den udbre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SJ er modtager af ph.d.-stipendiet fra DAE-TIFR, og bevillingen er anerkendt. KRV anerkender DBT B-Life-tilskuddet DBT/PR12422/MED/31/287/2014 og støtten fra Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikation nr. RTI4006.

Materials

CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  13. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  14. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  15. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  16. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  17. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  18. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  19. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  20. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  21. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  22. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  23. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  24. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  25. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  26. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  28. Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  29. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  30. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
  31. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  32. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  33. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  34. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  35. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  36. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  37. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  38. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  39. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Bioquímica. 62 (3), 735-746 (2023).
  40. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  41. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  42. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  43. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  44. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  45. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  46. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  47. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  48. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  49. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  50. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  51. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  52. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  53. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  54. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  55. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  56. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  57. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  58. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  59. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  60. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  61. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  62. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  63. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  64. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  65. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  66. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).
check_url/pt/66310?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image