Denne protokol introducerer de tilgængelige værktøjer til modellering af småmolekyleligander i cryoEM-kort over makromolekyler.
Dechifrering af protein-ligand-interaktionerne i et makromolekylært kompleks er afgørende for at forstå den molekylære mekanisme, underliggende biologiske processer og lægemiddeludvikling. I de senere år er kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket op som en kraftfuld teknik til at bestemme makromolekylers strukturer og til at undersøge ligandbindingstilstanden ved næsten atomar opløsning. Identifikation og modellering af ikke-proteinmolekyler i cryoEM-kort er ofte udfordrende på grund af anisotropisk opløsning på tværs af molekylet af interesse og iboende støj i dataene. I denne artikel introduceres læserne til forskellige software og metoder, der i øjeblikket bruges til ligandidentifikation, modelopbygning og forfining af atomare koordinater ved hjælp af udvalgte makromolekyler. En af de enkleste måder at identificere tilstedeværelsen af en ligand på, som illustreret med enolase-enzymet, er at trække de to kort opnået med og uden liganden. Den ekstra tæthed af liganden vil sandsynligvis skille sig ud i forskelskortet selv ved en højere tærskel. Der er tilfælde, som vist i tilfældet med metabotrop glutamatreceptor mGlu5, hvor sådanne simple forskelskort ikke kan genereres. Den nyligt introducerede metode til at udlede Fo-Fc udeladelseskortet kan tjene som et værktøj til at validere og demonstrere tilstedeværelsen af liganden. Endelig, ved hjælp af den velundersøgte β-galactosidase som eksempel, analyseres effekten af opløsning på modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i cryoEM-kort, og et syn på, hvordan cryoEM kan bruges til lægemiddelopdagelse, præsenteres.
Celler udfører deres funktioner ved at udføre utallige kemiske reaktioner samtidigt og uafhængigt, hver omhyggeligt reguleret for at sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som reaktion på miljømæssige signaler. Dette opnås ved molekylær genkendelse, som gør det muligt for biomolekyler, især proteiner, at danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler såvel som små molekyler eller ligander1. Således er protein-ligand-interaktioner grundlæggende for alle processer i biologien, som omfatter regulering af proteinekspression og aktivitet, enzymers genkendelse af substrater og cofaktorer, samt hvordan celler opfatter og videresender signaler 1,2. En bedre forståelse af de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskaber af protein-ligand-komplekset afslører det molekylære grundlag for ligandinteraktion og letter også rationelt lægemiddeldesign ved at optimere lægemiddelinteraktion og specificitet. En økonomisk og hurtigere tilgang til at studere protein-ligand-interaktion er at bruge molekylær docking, som er en beregningsmetode, der virtuelt screener en bred vifte af små molekyler og forudsiger bindingstilstanden og affiniteten af disse ligander til målproteiner3. Imidlertid giver eksperimentelle beviser fra højopløselige strukturer bestemt ved røntgendiffraktion (XRD), kernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det væsentlige bevis for sådanne forudsigelser og hjælper med udviklingen af nyere og mere effektive aktivatorer eller hæmmere for et givet mål. Denne artikel bruger forkortelsen ‘cryoEM’, som teknikken almindeligvis omtales. Der er dog en igangværende debat om valg af den korrekte nomenklatur, og for nylig er udtrykket kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blevet foreslået for at indikere, at prøven er ved kryogen temperatur og afbilledet med elektroner4. På samme måde er kortene afledt af cryoEM blevet kaldt elektronpotentiale, elektrostatisk potentiale eller Coulomb-potentiale, og for nemheds skyld bruger vi her cryoEM-kort 5,6,7,8,9,10.
Selvom XRD har været guldstandardteknikken til højopløsningsstrukturbestemmelse af protein-ligandkomplekser, har11 cryoEM efter opløsningsrevolution taget fart, som indikeret af stigningen i Coulomb-potentialekort eller kryoEM-kort deponeret i Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 i løbet af de sidste par år14. På grund af fremskridt inden for prøveforberedelse, billeddannelse og databehandlingsmetoder steg antallet af Protein Data Bank (PDB)14-aflejringer, der anvender cryoEM, fra 0,7 % til 17 % mellem 2010 og 2020, hvor ca. 50 % af de rapporterede strukturer i 2020 blev bestemt ved 3,5 Å opløsning eller bedre15,16. CryoEM er hurtigt blevet vedtaget af det strukturelle biologiske samfund, herunder medicinalindustrien, da det tillader undersøgelse af fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, især membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved næsten atomar opløsning, overvinde krystallisationsprocessen og opnå veldiffrakterende krystaller, der kræves til højopløsningsstrukturbestemmelse ved XRD.
Nøjagtig modellering af liganden i cryoEM-kortet er altafgørende, da det fungerer som en plan for protein-ligandkomplekset på molekylært niveau. Der er flere automatiserede ligandbygningsværktøjer, der bruges i røntgenkrystallografi, der afhænger af formen og topologien af ligandtætheden for at passe eller bygge liganden ind i elektrontætheden 17,18,19,20. Ikke desto mindre, hvis opløsningen er lavere end 3 Å, har disse tilgange en tendens til at give mindre ønskværdige resultater, fordi de topologiske træk, som de er afhængige af for at blive anerkendt og opbygget, bliver mindre definerede. I mange tilfælde har disse metoder vist sig at være ineffektive til nøjagtig modellering af ligander til kryoEM-kort, da disse kort er blevet bestemt i området lav til medium opløsning, typisk mellem 3,5 Å-5 Å17.
Det første trin i 3D-strukturbestemmelse af et protein-ligandkompleks ved cryoEM involverer enten samoprensning af liganden med proteinet (når liganden har en høj bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering af proteinopløsningen med liganden i en bestemt varighed før gitterforberedelse. Efterfølgende placeres et lille prøvevolumen på et plasmarenset hullet TEM-gitter, efterfulgt af flashfrysning i flydende ethan og til sidst billeddannelse med en kryo-TEM. 2D-projektionsbillederne fra hundredtusinder til millioner af individuelle partikler er gennemsnittet for at rekonstruere et 3-dimensionelt (3D) Coulomb-potentialekort over makromolekylet. Identifikation og modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i disse kort udgør betydelige udfordringer i mange tilfælde på grund af den anisotrope opløsning på tværs af kortet (dvs. opløsningen er ikke ensartet på tværs af makromolekylet), fleksibilitet i det område, hvor liganden er bundet, og støjen i dataene. Mange af de modellerings-, forfinings- og visualiseringsværktøjer, der blev udviklet til XRD, bliver nu tilpasset til brug i cryoEM til samme formål 18,19,20,21. I denne artikel præsenteres en oversigt over forskellige metoder og software, der i øjeblikket bruges til at identificere ligander, bygge modeller og forfine koordinaterne afledt af cryoEM. En trin-for-trin protokol er blevet leveret for at illustrere de processer, der er involveret i modellering af ligander ved hjælp af specifikke protein-ligandkomplekser med varierende opløsning og kompleksitet.
Det første trin i modellering af ligander i cryoEM-kort inkluderer identifikation af ligandtætheden (ikke-protein) i kortet. Hvis ligandbinding ikke inducerer nogen konformationsændring i proteinet, så fremhæver beregning af et simpelt forskelskort mellem protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i det væsentlige regionerne med ekstra tæthed, hvilket tyder på tilstedeværelsen af liganden. Sådanne forskelle kan observeres med det samme, da det kun kræver to kort, og selv mellemliggende kort under 3D-forfiningsprocessen kan bruges til at kontrollere, om liganden er til stede. Derudover, hvis opløsningen er høj nok (<3,0 Å), kan forskelskortet også give indsigt i placeringen af vandmolekyler såvel som ioner, der interagerer med liganden og proteinresterne.
I mangel af apo-protein-kortet er det nu muligt at bruge Servalcat22, som er tilgængeligt som et selvstændigt værktøj og også er blevet integreret i CCP-EM-softwarepakken23,24 som en del af Refmac-forfiningen og i CCP4 8.0 version25,26. Servalcat tillader beregning af et FSC-vægtet forskelskort (Fo-Fc) ved hjælp af de uskarpe halvafbildninger og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc udeladelseskortet repræsenterer forskellen mellem det eksperimentelle kort (Fo) og det kort, der er afledt af modellen (Fc). I mangel af en ligand i modellen antyder en positiv tæthed i et Fo-Fc-kort, der overlapper med det eksperimentelle EM-kort, typisk tilstedeværelsen af liganden. Antagelsen her er, at proteinkæden passer godt ind på kortet, og den resterende positive tæthed angiver ligandens placering. Det er dog vigtigt omhyggeligt at undersøge, om den positive tæthed stammer fra modelleringsunøjagtigheder, såsom den forkerte rotamer af en proteinsidekæde.
Det andet trin involverer opnåelse eller oprettelse af en kartesisk koordinatfil af liganden med veldefineret geometri fra den tilgængelige kemiske information. Standardligander (f.eks. ATP og NADP+), der allerede er tilgængelige i CCP4-monomerbiblioteket, kan bruges til forfining ved at hente koordinat- og geometrifilerne via deres monomertiltrædelseskode. For ukendte eller ikke-standardiserede ligander er der dog forskellige værktøjer til rådighed til at oprette geometrifilerne. Nogle af eksemplerne omfatter eLBOW27 – (elektronisk ligandbygger og optimeringsarbejdsbord) i Phoenix28, Lidia – et indbygget værktøj i Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-et modul af Glide i Schrödinger-pakken. Ligandkoordinatfilen monteres derefter i tætheden, styret af både det eksperimentelle kryoEM-kort og differenskortet i Coot. Dette efterfølges af forfining i det virkelige rum i Phoenix28 eller gensidig forfining i Refmac33. En Linux-arbejdsstation eller en bærbar computer udstyret med et godt grafikkort og ovennævnte software er påkrævet. De fleste af disse programmer er inkluderet i forskellige suiter. CCP-EM24 og Phenix28 er frit tilgængelige for akademiske brugere og inkluderer en række værktøjer, der bruges i denne artikel, herunder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine osv. På samme måde giver Chimera37 og ChimeraX38 gratis licenser til akademiske brugere.
Forbedringerne i mikroskophardware og -software har resulteret i en stigning i antallet af cryoEM-strukturer i de senere år. Selvom den højeste opløsning, der opnås i øjeblikket i enkeltpartikelkryoEM, er 1,2 Å 57,58,59, bestemmes størstedelen af strukturerne omkring 3-4 Å opløsning. Modellering af ligander i kort med medium til lav opløsning kan være vanskelig og ofte fyldt med tvetydighed. I betragtning af den udbre…
The authors have nothing to disclose.
SJ er modtager af ph.d.-stipendiet fra DAE-TIFR, og bevillingen er anerkendt. KRV anerkender DBT B-Life-tilskuddet DBT/PR12422/MED/31/287/2014 og støtten fra Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikation nr. RTI4006.
CCP4-8.0 | Consortium of several institutes | https://www.ccp4.ac.uk | Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography |
CCP-EM | Consortium of several institutes | https://www.ccpem.ac.uk/download.php | Free for academic users and includes Coot, Relion and many others |
Coot | Paul Emsley, LMB, Cambridge | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | General software for model building but also available with other suites described above |
DockinMap (Phenix) | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html | Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps |
Electron Microscopy Data Bank | Consortium of several institutes | https://www.ebi.ac.uk/emdb/ | Public Repository for Electron Microscopy maps |
Falcon | Thermo Fisher Scientific | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf | Commercial, camera from Thermo Fisher |
Phenix | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/download | Free for academic users and includes Coot |
Protein Data Bank | Consortium of several institutes | https://rcsb.org | Public database of macromolecular structures |
Pymol | Schrodinger | https://pymol.org/2/ | Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee. |
Relion | MRC-LMB, Cambridge | https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html | Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM |
Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE |
Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher |
UCSF Chimera | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html | General purpose software for display, analysis and more |
UCSF Chimera X | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ | General purpose software for display, analysis and more |