Modellering av ligander til kart avledet fra elektronkryomikroskopi

Summary

Denne protokollen introduserer verktøyene som er tilgjengelige for modellering av småmolekylære ligander i kryoEM-kart over makromolekyler.

Abstract

Å dechiffrere protein-ligand-interaksjonene i et makromolekylært kompleks er avgjørende for å forstå den molekylære mekanismen, underliggende biologiske prosesser og legemiddelutvikling. De siste årene har kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket opp som en kraftig teknikk for å bestemme strukturene til makromolekyler og for å undersøke modusen for ligandbinding ved nær atomoppløsning. Å identifisere og modellere ikke-proteinmolekyler i kryoEM-kart er ofte utfordrende på grunn av anisotrop oppløsning på tvers av molekylet av interesse og iboende støy i dataene. I denne artikkelen blir leserne introdusert for ulike programvarer og metoder som i dag brukes til ligandidentifikasjon, modellbygging og foredling av atomkoordinater ved hjelp av utvalgte makromolekyler. En av de enkleste måtene å identifisere tilstedeværelsen av en ligand på, som illustrert med enolase-enzymet, er å trekke fra de to kartene oppnådd med og uten liganden. Den ekstra tettheten til liganden vil sannsynligvis skille seg ut i differansekartet selv ved en høyere terskel. Det er tilfeller, som vist i tilfellet med metabotrope glutamatreseptor mGlu₅, når slike enkle forskjellskart ikke kan genereres. Den nylig introduserte metoden for å utlede Fo-Fc utelatelseskartet kan tjene som et verktøy for å validere og demonstrere tilstedeværelsen av liganden. Til slutt, ved å bruke den godt studerte β-galaktosidasen som eksempel, analyseres effekten av oppløsning på modellering av ligander og løsningsmiddelmolekyler i kryoEM-kart, og et syn på hvordan kryoEM kan brukes i legemiddeloppdagelse presenteres.

Introduction

Celler utfører sine funksjoner ved å utføre utallige kjemiske reaksjoner samtidig og uavhengig, hver omhyggelig regulert for å sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som svar på miljøsignaler. Dette oppnås ved molekylær gjenkjenning, som gjør det mulig for biomolekyler, spesielt proteiner, å danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler så vel som små molekyler eller ligander¹. Dermed er protein-ligand-interaksjoner grunnleggende for alle prosesser i biologi, som inkluderer regulering av proteinuttrykk og aktivitet, gjenkjennelse av substrater og kofaktorer av enzymer, samt hvordan celler oppfatter og videresender signaler ^1,2. En bedre forståelse av de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskapene til protein-ligand-komplekset avslører det molekylære grunnlaget for ligandinteraksjon og letter også rasjonell legemiddeldesign ved å optimalisere legemiddelinteraksjon og spesifisitet. En økonomisk og raskere tilnærming til å studere protein-ligand-interaksjon er å bruke molekylær dokking, som er en beregningsmetode som praktisk talt screener et mangfoldig utvalg av små molekyler og forutsier bindingsmodusen og affiniteten til disse ligandene til målproteiner³. Imidlertid gir eksperimentelle bevis fra høyoppløselige strukturer bestemt av røntgendiffraksjon (XRD), kjernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det essensielle beviset for slike spådommer og hjelper til med utviklingen av nyere og mer effektive aktivatorer eller hemmere for et gitt mål. Denne artikkelen bruker forkortelsen ‘cryoEM’ som teknikken ofte refereres til. Imidlertid er det en pågående debatt om valg av riktig nomenklatur, og nylig har begrepet kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blitt foreslått for å indikere at prøven er ved kryogen temperatur og avbildet med elektroner⁴. På samme måte har kartene avledet fra cryoEM blitt kalt elektronpotensial, elektrostatisk potensial eller Coulomb-potensial, og for enkelhets skyld bruker vi her kryoEM-kart 5,6,7,8,9,10.

Selv om XRD har vært gullstandardteknikken i høyoppløselig strukturbestemmelse av protein-ligandkomplekser, har kryoEM etter oppløsningsrevolusjon¹¹ fått fart, som indikert av økningen av Coulomb-potensialkart eller kryoEM-kart deponert i Electron Microscopy Database (EMDB)^12,13 i løpet av de siste årene¹⁴. På grunn av fremskritt innen prøvepreparering, avbildning og databehandlingsmetoder, økte antallet Protein Data Bank (PDB)^{14-avsetninger} som bruker kryoEM fra 0,7 % til 17 % mellom 2010 og 2020, med omtrent 50 % av rapporterte strukturer i 2020 bestemt ved 3,5 Å oppløsning eller bedre^15,16. CryoEM har raskt blitt tatt i bruk av det strukturelle biologiske miljøet, inkludert farmasøytisk industri, da det tillater studier av fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, spesielt membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved nær atomoppløsning, overvinne krystalliseringsprosessen og oppnå godt diffrakterende krystaller som kreves for høyoppløselig strukturbestemmelse av XRD.

Nøyaktig modellering av liganden i cryoEM-kartet er avgjørende, siden det fungerer som en blåkopi av protein-ligandkomplekset på molekylært nivå. Det er flere automatiserte ligandbyggingsverktøy som brukes i røntgenkrystallografi som avhenger av formen og topologien til ligandtettheten for å passe eller bygge liganden inn i elektrontettheten 17,18,19,20. Likevel, hvis oppløsningen er lavere enn 3 Å, har disse tilnærmingene en tendens til å gi mindre ønskelige resultater fordi de topologiske egenskapene de er avhengige av for gjenkjennelse og bygging blir mindre definerte. I mange tilfeller har disse metodene vist seg ineffektive for nøyaktig modellering av ligander til kryoEM-kart, da disse kartene har blitt bestemt i området lav til middels oppløsning, typisk mellom 3,5 Å-5 Ź⁷.

Det første trinnet i 3D-strukturbestemmelse av et protein-ligandkompleks ved cryoEM innebærer enten samrensing av liganden med proteinet (når liganden har høy bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering av proteinløsningen med liganden i en bestemt varighet før gitterforberedelse. Deretter plasseres et lite prøvevolum på et plasmarenset hullete TEM-gitter, etterfulgt av flashfrysing i flytende etan og til slutt avbildning med en kryo-TEM. 2D-projeksjonsbildene fra hundretusener til millioner av individuelle partikler er gjennomsnittet for å rekonstruere et 3-dimensjonalt (3D) Coulomb-potensialkart over makromolekylet. Identifisering og modellering av ligander og løsningsmiddelmolekyler i disse kartene utgjør betydelige utfordringer i mange tilfeller på grunn av den anisotrope oppløsningen på tvers av kartet (dvs. oppløsningen er ikke ensartet over makromolekylet), fleksibilitet i regionen der liganden er bundet, og støyen i dataene. Mange av modellerings-, foredlings- og visualiseringsverktøyene som ble utviklet for XRD blir nå tilpasset for bruk i cryoEM for samme formål 18,19,20,21. I denne artikkelen presenteres en oversikt over ulike metoder og programvare som for tiden brukes til å identifisere ligander, bygge modeller og avgrense koordinatene avledet fra cryoEM. En trinn-for-trinn-protokoll er gitt for å illustrere prosessene som er involvert i modellering av ligander ved bruk av spesifikke protein-ligandkomplekser med varierende oppløsning og kompleksitet.

Det første trinnet i modellering av ligander i kryoEM-kart inkluderer identifisering av ligandtettheten (ikke-protein) i kartet. Hvis ligandbinding ikke induserer noen konformasjonsendring i proteinet, fremhever beregning av et enkelt forskjellskart mellom protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i hovedsak regionene med ekstra tetthet, noe som tyder på tilstedeværelsen av liganden. Slike forskjeller kan observeres umiddelbart, da det bare krever to kart, og til og med mellomkart under prosessen med 3D-foredling kan brukes til å sjekke om liganden er tilstede. I tillegg, hvis oppløsningen er høy nok (<3,0 Å), kan differansekartet også gi innsikt i plasseringen av vannmolekyler så vel som ioner som interagerer med liganden og proteinrestene.

I fravær av apo-proteinkartet er det nå mulig å bruke Servalcat²², som er tilgjengelig som et frittstående verktøy og også har blitt integrert i CCP-EM-programvarepakken^23,24 som en del av Refmac-foredlingen og i CCP4 8.0 versjon^25,26. Servalcat tillater beregning av et FSC-vektet differansekart (Fo-Fc) ved å bruke de uskarpe halvkartene og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc utelatelseskartet representerer forskjellen mellom det eksperimentelle kartet (Fo) og kartet avledet fra modellen (Fc). I fravær av en ligand i modellen, antyder en positiv tetthet i et Fo-Fc-kart som overlapper med det eksperimentelle EM-kartet vanligvis tilstedeværelsen av liganden. Antakelsen her er at proteinkjeden er godt tilpasset i kartet, og den gjenværende positive tettheten indikerer plasseringen av liganden. Det er imidlertid viktig å undersøke nøye om den positive tettheten stammer fra modelleringsunøyaktigheter, for eksempel feil rotamer av en proteinsidekjede.

Det andre trinnet innebærer å skaffe eller lage en kartesisk koordinatfil av liganden med veldefinert geometri fra tilgjengelig kjemisk informasjon. Standard ligander (for eksempel ATP og NADP⁺) som allerede er tilgjengelige i CCP4-monomerbiblioteket kan brukes til foredling ved å hente koordinat- og geometrifilene via deres monomertiltredelseskode. For ukjente eller ikke-standardiserte ligander er imidlertid ulike verktøy tilgjengelige for å lage geometrifilene. Noen av eksemplene inkluderer eLBOW²⁷ – (elektronisk ligandbygger og optimaliseringsarbeidsbenk) i Phoenix²⁸, Lidia – et innebygd verktøy i Coot²⁹, JLigand/ACEDRG ^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-a-modul av Glide i Schrödinger-suiten. Ligandkoordinatfilen blir deretter montert i tettheten, styrt av både det eksperimentelle kryoEM-kartet og differansekartet i Coot. Dette etterfølges av raffinement i sanntid i Phoenix²⁸ eller gjensidig raffinement i Refmac³³. En Linux-arbeidsstasjon eller en bærbar datamaskin utstyrt med et godt grafikkort og ovennevnte programvare kreves. De fleste av disse programmene er inkludert i ulike suiter. CCP-EM²⁴ og Phenix²⁸ er fritt tilgjengelige for akademiske brukere og inkluderer en rekke verktøy som brukes i denne artikkelen, inkludert Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. På samme måte gir Chimera³⁷ og ChimeraX³⁸ gratis lisenser til akademiske brukere.

Protocol

1. Modellering av fosfoenolpyruvat (PEP) i enolase fra Mycobacterium tuberculosis Identifisering av ligandtetthet i kryoEM-kartet over PEP-enolase-kompleksetLast ned de uskarpe halvkartene (emd_30988_additional_1.map og emd_30988_additional_2.map) av apo-enolase fra tilleggsdataene i EMDB (se materialfortegnelse). Åpne ChimeraX (se materialfortegnelse). Åpne halvkartene til apo-enolase ved å klikke på Åpne fra v…

Representative Results

Eksempel 1Enzymet enolase fra M. tuberculosis katalyserer det nest siste trinnet av glykolyse og omdanner 2-fosfoglyserat til fosfoenolpyruvat (PEP), som er et essensielt mellomprodukt for flere metabolske veier44,45. CryoEM-data for apo-enolase- og PEP-bundne enolaseprøver ble samlet inn med samme pikselstørrelse på 1,07 Å, og bildebehandling ble utført med Relion 3,146,47</s…

Discussion

Forbedringene i mikroskopmaskinvare og -programvare har resultert i en økning i antall kryoEM-strukturer de siste årene. Selv om den høyeste oppløsningen som er oppnådd for øyeblikket i enkeltpartikkelkryoEM er 1,2 Å 57,58,59, blir flertallet av strukturene bestemt rundt 3-4 Å oppløsning. Modellering av ligander i kart med middels til lav oppløsning kan være vanskelig og ofte full av tvetydighet. Gitt den utbredte bru…

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more