O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .
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Artigo de método
Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O patógeno bacteriano entérico adaptado ao ser humano Shigella causa milhões de infecções a cada ano, cria efeitos de crescimento a longo prazo entre pacientes pediátricos e é uma das principais causas de mortes diarreicas em todo o mundo. A infecção induz diarreia aquosa ou sanguinolenta como resultado do patógeno transitar pelo trato gastrointestinal e infectar as células epiteliais que revestem o cólon. Com aumentos impressionantes na resistência aos antibióticos e a atual falta de vacinas aprovadas, protocolos de pesquisa padronizados são críticos para estudar esse formidável patógeno. Aqui, metodologias são apresentadas para examinar a patogênese molecular de Shigella usando análises in vitro de adesão, invasão e replicação intracelular bacteriana em células epiteliais colônicas. Antes das análises da infecção, o fenótipo de virulência das colônias de Shigella foi verificado pela absorção do corante vermelho Congo em placas de ágar. Meios laboratoriais suplementados também podem ser considerados durante a cultura bacteriana para mimetizar condições in vivo . As células bacterianas são então utilizadas em um protocolo padronizado para infectar células epiteliais colônicas em placas de cultura de tecidos em uma multiplicidade estabelecida de infecção com adaptações para analisar cada estágio da infecção. Para os ensaios de aderência, as células de Shigella são incubadas com níveis reduzidos de meios para promover o contato bacteriano com as células epiteliais. Tanto para ensaios de invasão quanto para replicação intracelular, a gentamicina é aplicada por vários intervalos de tempo para eliminar bactérias extracelulares e permitir a avaliação da invasão e/ou a quantificação das taxas de replicação intracelular. Todos os protocolos de infecção enumeram bactérias aderentes, invadidas e/ou intracelulares diluindo em série lisados de células epiteliais infectadas e plaqueando unidades formadoras de colônias bacterianas em relação aos títulos infectantes em placas de ágar vermelho Congo. Em conjunto, esses protocolos permitem caracterizar e comparar de forma independente cada estágio da infecção por Shigella em células epiteliais para estudar este patógeno com sucesso.
Introdução
As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos 1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo3. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda 4,5<....
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Protocolo
1. Preparação de reagentes e materiais
NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.
- Meio TSB: Adicionar 0,5 L de água deionizada (DI) a 15 g de caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabela de Materiais) meio e autoclave. Conservar à temperatura ambiente.
- Meio de sais biliares (TSB + BS): Para preparar TSB contendo 0,4% (p/v) de sais biliares, ressuspenda 0,06 g de sais biliares (BS, ver Tabela de Materiais) em 15 mL de TSB autoclavado. Esterilizar o filtro usando um filtro de PES de 0,22 μm.
NOTA: Os sais biliares consistem numa mist....
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Resultados
Ensaios de aderência, invasão e replicação intracelular foram realizados comparando S. flexneri 2457T wild type (WT) com S. flexneri ΔVF (ΔVF), um mutante hipotetizado para regular negativamente a virulência de Shigella. Como Shigella utiliza sais biliares como sinal para regular a virulência 17,18,47, experimentos foram realizados após subcultivo bacteriano em meio TSB e TSB suplementado com sais biliares a 0,4% (p/v)
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Discussão
Este protocolo descreve um conjunto de três ensaios padronizados para estudar a adesão, invasão e replicação intracelular de células epiteliais intestinais por Shigella. Embora esses métodos sejam apenas versões modificadas dos ensaios clássicos de gentamicina usados para estudar a invasão e replicação intracelular de vários patógenos bacterianos dentro das células hospedeiras 49,50,51, considerações especiais devem ser aplicadas no estudo
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
O apoio aos autores inclui o Departamento de Pediatria do Hospital Geral de Massachusetts, o prêmio 2022A009041 do Comitê Executivo de Financiamento de Apoio Provisório à Pesquisa (ISF), o R21AI146405 de concessão do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concedem o Centro de Pesquisa em Obesidade Nutricional em Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Filtro PES | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Filtro estéril de polietersulfona para esterilização de até 50 mL de mídia |
| Tubos de cultura de 14 mL Tubos | de ensaio de polipropileno Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm com tampa |
| Tubos cônicos de 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL de polipropileno transparente com tampa à prova de vazamentos |
| Placas de cultura de tecidos de 6 poços | Corning | 3516 | As placas são tratadas para uma fixação celular ideal |
| Sais biliares | Sigma-Aldrich | B8756 | Proporção de 1:1 de colato para desoxicolato |
| Corante vermelho Congo | Sigma-Aldrich | C6277 | Um corante diazo aniônico à base de benzidina, >85% de pureza |
| Corrediça de câmara de contagem de células Countess | Invitrogen | C10283 | Para ser usado com o Contador de Células Automatizado Countess |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A um reagente orgânico altamente polar |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM é suplementado com alta glicose, piruvato de sódio, GlutaMAX e Fenol Vermelho |
| Fetal Soro Bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Gentamicina estéril inativada por calor |
| Sigma-Aldrich | G3632 | A concentração de estoque é de 50 mg/mL | |
| Linha celular HT-29 Linha celular | ATCC | HTB-38 | Linha celular de adenocarcinoma; colorretal em origem |
| Filme de parafina | Bemis | PM999 | Filme de vedação de laboratório |
| Placas de Petri | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Placas de Petri para meios sólidos |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | concentração de 1x; pH 7,4 |
| Selecione o ágar | Invitrogen | 30391023 | Uma mistura de polissacarídeos extraídos das paredes celulares de algas vermelhas para fazer meio de plaqueamento bacteriano |
| Frascos T75 | Corning | 430641U | Frascos de cultura de tecidos |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Um surfactante e emulsificante não iônico comum |
| Corante azul de tripano | Invitrogen | T10282 | Um corante para detectar células mortas de cultura de tecidos; apenas células vivas podem excluir o corante |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagente para dissociação celular para manutenção e passagem |
| linha celular Caldo de soja tríptico (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Meio de crescimento bacteriano |
Referências
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
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Reimpressões e permissões
