O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .
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Artigo de método
Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve a produção e purificação de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, um método agnóstico de sorotipo para purificação de AAV descrito pela primeira vez em 1999. Os vetores rAAV são amplamente utilizados em aplicações de terapia gênica para entregar transgenes a vários tipos de células humanas. Neste trabalho, o vírus recombinante é produzido pela transfecção de células Expi293 em cultura de suspensão com plasmídeos que codificam os genes transgene, capsídeo vetorial e adenoviral auxiliar. A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol purifica partículas completas de AAV com base na densidade de partículas. Além disso, três etapas são incluídas nesta metodologia agora onipresente para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação devido a proteínas contaminantes e concentrar ainda mais o produto final do vírus, respectivamente: precipitação de partículas virais do meio celular usando uma solução de polietilenoglicol (PEG) e cloreto de sódio, a introdução de uma segunda rodada de centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, e troca de buffer através de filtro centrífugo. Usando este método, é possível obter consistentemente títulos na faixa de 10a 12 partículas virais/mL de pureza excepcional para uso in vivo .
Introdução
Os vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) são ferramentas amplamente utilizadas para o tratamento de doenças genéticas, incluindo atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana e hemofilia A 1,2,3. Os vetores rAAV são projetados para não ter genes virais presentes no AAV4 selvagem, um vírus icosaédrico pequeno e não envelope com um genoma linear de DNA de fita simples de 4,7 kb. O AAV foi descoberto na década de 1960 como contaminante de preparações de adenovírus5. Apesar de seu pequeno tamanho do capsídeo, que limi....
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Protocolo
A composição das soluções e buffers utilizados neste protocolo são apresentados na Tabela 1.
| Solução | Composição | |
| Tampão de lise AAV | 1,2 mL de solução de NaCl 5 M | |
| 2 mL de solução 1 M Tris-HCl pH 8,5 | ||
| 80 uL de solução de 1 M MgCl2 | ||
| mQ água até 40 mL | ||
| Solução de precipitação AAV | 40 g PEG 800.... | |
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Resultados
Este método pode ser usado para obter títulos de pelo menos10 a 12 partículas virais por mL. Um título pode ser obtido (Figura 3) por qPCR usando os primers ITR fornecidos na Tabela Suplementar 1, por ddPCR ou por qualquer outro método de titulação. Títulos subótimos podem resultar do uso de um gene de tampa que codifica um capsídeo com baixa eficiência de embalagem.
Outra possível fonte de resultados subótimos é a baixa eficiê.......
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Discussão
O protocolo de purificação com gradiente de densidade de iodixanol duplo é o método universal, pois é aplicável a qualquer variante mutante do AAV, independentemente de sua especificidade receptora. Os primeiros métodos de purificação de AAV baseavam-se na densidade de partículas e incluíam centrifugação isopicnica em CsCl e centrifugação contínua por gradiente de densidade de sacarose19. Posteriormente, foram desenvolvidas abordagens sorotipo-específicas, que utilizaram anticorpos monoclonais lig.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações a relatar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Centrífuga de bancada 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| bomba peristáltica de 8 canais | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Contador de células automatizado | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Incubadora | 322491101 de CO | ||
| 2 Labconco com agitador | Definido em 8% CO2 e 37 ° C | ||
| Tubos de centrífuga cônicos | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Tubos de centrífuga cônicos | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Micro-pipetas descartáveis | Fisherbrand | 21-164-2G | Capilares |
| Dulbecco tampão fosfato salino sem CaCl2 e MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F células | Gibco | A14527 | |
| Pontas de filtro | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µ L |
| Pontas de filtro | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µ L |
| Pontas de filtro | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µ L |
| Pontas de filtro | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µ L |
| Agulhas hipodérmicas | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Balde de gelo com tampa | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Solução de cloreto de magnésio (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Suporte e braçadeira de metal | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Tubos de microcentrífuga | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Alicate | |||
| Ultracentrífuga Optima XE-90 Beckman | Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Meio de soro reduzido | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep mídia de gradiente de densidade (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | Solução de iodixanol a 60% |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Vermelho de fenol solução | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Controlador de pipeta Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmídeo pCapsídeo | De novo ou Addgene, etc. | N/A | Usamos pACGrh74. |
| Plasmídeo pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmídeo pTransgene | De novo ou Addgene, etc. | N/A | Utilizou-se pdsAAV-GFP. |
| Solução de poliol Plurônico F-68 (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polietilenoglicol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polietileninimina HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Diluir em água a 40 μ M |
| Tubos de centrífuga de polipropileno, 431123 de polipropileno estéreis | Corning | 500 mL | |
| Tubos de centrífuga de polipropileno, 430776 de polipropileno estéril | 250 mL | ||
| Pipetas sorológicas | |||
| SP225-B | 25 mL | ||
| Pipetas sorológicas | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Pipetas sorológicas | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Balões agitadores | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Balões agitadores | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Balões agitados | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Frascos agitados | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Solução de cloreto de sódio (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Seringas estéreis | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Filtro de seringa | Millipore | SLGV013SL | 0,22 mícron |
| Tris-HCl pH 8,5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solução | Gibco | 15250061 | |
| Conjunto de rack de tubos | Beckman Coulter | 361646 | |
| Espaçadores de tubos (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubulação para bomba peristáltica | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Rotor de titânio de ângulo fixo Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Freezer de temperatura ultrabaixa | Fixado em -70 ° C | ||
| Vivaspin 20 concentrador centrífugo | Sartorius | VS2041 | |
| Banho-maria | Fixado em 37 > O |
Referências
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
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Reimpressões e permissões
