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Artigo de método

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

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DOI:

10.3791/66463

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29 de março de 2024

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, School of Medicine, Emory University, 2Department of Human Genetics, School of Medicine, Emory University

Neste artigo

Resumo

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Resumo

A terapia gênica é uma tecnologia poderosa para fornecer novos genes a um paciente para o tratamento da doença, seja para introduzir um gene funcional, inativar um gene tóxico ou fornecer um gene cujo produto pode modular a biologia da doença. O método de entrega do vetor terapêutico pode assumir várias formas, desde a infusão intravenosa para administração sistêmica até a injeção direta no tecido-alvo. Para distúrbios neurodegenerativos, muitas vezes é desejável inclinar a transdução para o cérebro e/ou medula espinhal. A abordagem menos invasiva para atingir todo o sistema nervoso central envolve a injeção no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que a terapêutica atinja uma grande fração do sistema nervoso central. A abordagem mais segura para administrar um vetor no LCR é a injeção intratecal lombar, onde uma agulha é introduzida na cisterna lombar da medula espinhal. Essa técnica, também conhecida como punção lombar, tem sido amplamente utilizada em roedores neonatais e adultos e em modelos animais de grande porte. Embora a técnica seja semelhante entre espécies e estágios de desenvolvimento, diferenças sutis no tamanho, estrutura e elasticidade dos tecidos ao redor do espaço intratecal requerem acomodações na abordagem. Este artigo descreve um método para realizar punção lombar em ratos juvenis para fornecer um vetor adeno-associado do sorotipo 9. Aqui, 25-35 μL de vetor foram injetados na cisterna lombar, e um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para avaliar o perfil de transdução resultante de cada injeção. Os benefícios e desafios dessa abordagem são discutidos.

Introdução

A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outra função benéfica.

Para doenças que afetam o sistema nervoso central (SNC), a entrega do vetor de terapia gênica diretamente ao tecido-alvo é frequentemente desejável. As abordagens não sistêmicas oferecem dois benefícios: minimizam os efeitos colaterais fora do alvo que podem ser causados pela transdução periférica e reduzem muito a quantidade de vetor necessária para atingir níveis adequados de transdução no tecido-alvo5.

Há uma variedade de abordagens para fornecer vetores de terapia gênica ao SNC. A injeção intraparenquimatosa, a injeção de um vetor diretamente na medula espinhal ou no tecido cerebral, pode ser usada para entrega em uma região definida. No entanto, para muitas doenças, a transdução ampla do SNC é desejada. Isso pode ser feito entregando um vetor ao líquido cefalorraquidiano (LCR)5, o fluido que flui dentro e ao redor do cérebro e da medula espinhal. Existem três maneiras principais de fornecer vetores ao LCR. A abordagem mais invasiva é a entrega intracerebroventricular, que envolve a perfuração de um orifício no crânio e o avanço de uma agulha através do cérebro até os ventrículos laterais. Isso produz transdução por todo o cérebro. No entanto, o procedimento pode causar hemorragia intracraniana, e a abordagem geralmente produz apenas transdução limitada da medula espinhal6. A injeção na cisterna magna na base do crânio é menos invasiva, mas traz o risco de danos ao tronco cerebral. Embora frequentemente usada em pesquisas com animais5, a injeção na cisterna magna não é mais usada rotineiramente na clínica7. A punção lombar é a abordagem menos invasiva para acessar o LCR. Isso envolve colocar uma agulha entre duas vértebras lombares e na cisterna lombar.

A punção lombar para entrega do vetor é realizada rotineiramente em ratos e camundongos adultos e em camundongos neonatais 8,9. Os autores deste estudo realizaram recentemente punções lombares em ratos juvenis (28-30 dias de idade) para fornecer vetores do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9). Em ratos adultos, uma agulha de punção lombar neonatal foi colocada verticalmente entre as vértebras L3 e L49. O posicionamento adequado resulta em um movimento da cauda e no LCR fluindo para o reservatório da agulha. Em ratos juvenis, porém, nenhuma dessas leituras pôde ser alcançada. Os autores então tentaram adaptar um procedimento de camundongo adulto usando uma seringa de insulina 27 G inserida em um ângulo entre L5 e L610. Em camundongos adultos, que normalmente são menores que os ratos P28, isso não produz um movimento da cauda, mas a colocação incorreta da agulha é evidente pelo refluxo do injetado. Em ratos juvenis, no entanto, essa abordagem levou uniformemente ao injetado ser administrado por via epidural, provavelmente resultante de diferentes elasticidades entre camundongos adultos e ratos juvenis das camadas de tecido ao redor da medula espinhal. As abordagens por cateter foram avaliadas em seguida. Especificamente, um cateter foi introduzido através de uma incisão na dura-máter da cisterna lombar e até a medula espinhal torácica média; no entanto, essa abordagem levou a um refluxo substancial do injetado de volta para fora do local da incisão durante o parto. As tentativas de colocar o cateter no espaço intratecal por via percutânea com agulha-guia também não tiveram sucesso. Devido à estreiteza da largura interlaminar, o cateter provavelmente atingiria a lâmina rostral e não avançaria.

Aqui, é descrito um método para obter uma entrega de solução bem-sucedida e reprodutível por meio de uma punção lombar no rato juvenil. Essa abordagem pode ser usada para vetores virais e, provavelmente, também para células, produtos farmacêuticos e outras terapêuticas.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC). Ratos Sprague-Dawley (28-30 dias de idade, massa na faixa de cerca de 90-135 g, machos e fêmeas) foram utilizados no presente estudo.

1. Preparação do vetor

  1. Descongele o vetor AAV9 (consulte a Tabela de Materiais) no gelo no início do procedimento.
  2. Centrifugue brevemente o tubo de microcentrífuga contendo o vetor em uma centrífuga de mesa para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo.
  3. Agite suavemente o tubo da microcentrífuga para garantir que a solução esteja bem misturada.

2. Preparação da gaiola de recuperação

  1. Coloque uma gaiola limpa em um cobertor elétrico (consulte a Tabela de Materiais) de forma que apenas metade da gaiola fique em contato com o cobertor.
  2. Defina a temperatura da manta para ~37 °C.

3. Preparação da plataforma cirúrgica

  1. Aqueça uma almofada isotérmica (consulte a Tabela de Materiais) a 39 ° C em um micro-ondas ou banho-maria para que o conteúdo fique líquido.
  2. Coloque a almofada isotérmica na plataforma cirúrgica e cubra-a com uma almofada de bancada absorvente limpa.

4. Preparação animal

  1. Anestesiar os ratos com isoflurano em uma caixa transparente (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Iniciar a indução anestésica com isoflurano a 5% e diminuir 1% por minuto até atingir 2%. Mantenha o animal a 2% por mais 3 min.
  2. Mova a caixa que prende o animal a um exaustor e abra a caixa.
    NOTA: Isso limita a exposição do cirurgião ao anestésico.
  3. Remova o cabelo da parte de trás do animal usando uma máquina de cortar cabelo elétrica.
    NOTA: Alternativamente, um creme depilatório ou navalha manual e creme de barbear podem ser usados.
  4. Coloque o animal na plataforma cirúrgica com o focinho no cone do nariz da anestesia.
    NOTA: O animal pode começar a recuperar a consciência enquanto o pelo é removido do local da cirurgia. Se isso acontecer, anestesia-o novamente conforme descrito acima.
  5. Aplique pomada lubrificante para os olhos em cada olho para evitar o ressecamento das córneas durante o procedimento.
  6. Desinfetar a área cirúrgica usando três aplicações alternadas de lenços umedecidos de iodopovidona e isopropanol.
  7. Injete o(s) analgésico(s) por via subcutânea.
    NOTA: A buprenorfina é geralmente usada na dose de 0,01-0,05 mg / kg, administrada a cada 12 h. Alternativamente, uma forma de liberação lenta deste medicamento pode ser administrada uma vez a 1 mg / kg para fornecer controle adequado da dor por 72 h. Consulte o IACUC da instituição para obter suas diretrizes sobre o controle da dor.
  8. Injete 100 μL de lidocaína a 1% por via subcutânea acima dos processos espinhosos L2 a L6 para fornecer anestesia local.
  9. Coloque um rolo de papel toalha ou um tubo de 1,5 cm de diâmetro sob o animal, apenas rostral até os quadris. Isso ajuda a flexionar a coluna, facilitando a inserção da agulha entre as duas lâminas.
  10. Coloque uma cortina fenestrada (ver Tabela de Materiais) no animal, centralizando a fenestração sobre a coluna lombar.

5. Expondo a coluna lombar

  1. Confirme a profundidade da anestesia beliscando cada uma das patas do animal e procurando a ausência de uma resposta de retirada.
  2. Usando uma lâmina de bisturi #11, faça uma incisão de aproximadamente 3 cm de comprimento na pele na linha média de L2 a L6.
  3. Afrouxe a pele do músculo inserindo uma tesoura cirúrgica curva estéril entre o músculo e a pele e, em seguida, abrindo as pontas.
  4. Remova a fáscia que cobre os processos espinhosos L2-L5.

6. Carregamento da seringa

  1. Pipetar 25-35 μL do vector (para atingir a dose desejada) para dentro da tampa de um tubo de microcentrífuga estéril.
  2. Aspire todo o volume para a seringa de insulina.
    NOTA: Tome cuidado para não aspirar ar durante este processo.

7. Realizando a injeção

  1. Identifique os processos espinhosos L5 e L4.
    NOTA: L6 fica diretamente entre as duas cristas ilíacas e seu processo espinhoso deve ser fácil de identificar por sondagem com um instrumento rombudo. O instrumento pode então ser executado suavemente na parte de trás para encontrar os limites dos processos L5 e L4.
  2. Coloque uma mão de forma que o polegar descanse suavemente na cauda e na perna do animal. Use um dedo para firmar a seringa.
  3. Posicione a agulha da seringa de forma que fique à esquerda do processo espinhoso L5 e alinhada com sua extremidade caudal. Posicione a seringa de forma a que fique a cerca de 30° da linha média e 30° acima do plano da mesa.
    NOTA: Pode ser útil usar um microscópio cirúrgico para identificar melhor os pontos de referência e posicionar a ponta da agulha.
  4. Avance a agulha da seringa para a frente cerca de 8 mm, por cima da lâmina L5 e depois por baixo da lâmina L4 no autoclismo lombar até atingir o osso. O posicionamento correto resultará em uma contração da perna e/ou cauda que pode ser vista ou sentida pelo polegar apoiado na perna/cauda. Se não houver contração, remova a agulha e tente o procedimento pelo lado esquerdo. Se ainda não houver contração, repita o procedimento entre L4/L3 e L3/L2 conforme necessário.
  5. Pressione o êmbolo lentamente por cerca de 5 s.
    NOTA: Pode haver uma contração na perna ou cauda durante a injeção.
  6. Segure a seringa no lugar por cerca de 30 s depois de pressionar totalmente o êmbolo para permitir que a pressão se equilibre e minimize o refluxo do injetado quando a agulha for retirada.
  7. Remova lentamente a agulha.

8. Fechamento da incisão

  1. Aproxime as bordas da incisão.
  2. Começando em uma extremidade da ferida, use uma sutura 4-0 (consulte a Tabela de Materiais) ou grampos cirúrgicos para fechar a incisão.

9. Recuperação e monitorização

  1. Coloque o animal na gaiola pré-aquecida.
  2. Verifique o animal pelo menos a cada 15 minutos até que esteja totalmente deambulatório.
    NOTA: Isso deve levar entre 15 minutos e 45 minutos.
  3. Nos próximos três dias, faça verificações de bem-estar pelo menos diariamente. Forneça analgésicos nos primeiros 2 dias após a cirurgia ou conforme exigido pelo IACUC.
  4. Uma semana após a cirurgia, remova as suturas ou grampos.

10. Procedimento de acompanhamento

NOTA: Para determinar a precisão da técnica de injeção, injete o corante azul de tripano conforme descrito acima e, em seguida, eutanasiar imediatamente o animal (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) e realizar uma laminectomia para visualizar o resultado.

  1. Enquanto o animal permanecer sob anestesia, eutanasia-o administrando uma dose letal de pentobarbital via injeção intraperitoneal na dose de 150 mg/kg.
  2. Assim que a respiração e a atividade cardíaca cessarem, abra a cavidade torácica para garantir a morte. Estenda a incisão cirúrgica até as costas até o pescoço.
  3. Faça uma incisão de 4 cm de comprimento no músculo paralelo à coluna vertebral em ambos os lados dos processos espinhosos, mantendo-se o mais próximo possível dos processos.
  4. Usando uma pinça fina ou tesoura, remova o músculo entre os processos espinhosos.
  5. Remova os processos espinhosos de L6 até a coluna torácica inferior usando um rongeur (ver Tabela de Materiais). Evite movimentos de torção, pois isso pode danificar os rongeurs.
  6. Insira a ponta inferior do rongeur sob a lâmina L5 e remova o osso que cobre a medula espinhal dando várias "mordidas" nele.
    NOTA: Puxar para trás o processo espinhoso L6 pode facilitar a inserção da ponta do rongeur. Deve-se tomar cuidado para evitar danos à medula espinhal.
  7. Continue expandindo a laminectomia pelo menos quatro lâminas rostralmente. Inspecione a superfície interna das lâminas em busca de sinais de corante, o que pode indicar uma injeção com falha.

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Resultados

Para determinar a precisão da técnica de injeção, um corante, azul de tripano, foi usado como substituto para a terapêutica. Esse corante se liga prontamente às proteínas, por isso geralmente permanece dentro da estrutura na qual foi injetado. Isso significa que o corante pode não prever com precisão a distribuição pós-injeção da terapêutica; é simplesmente usado para revelar a precisão da injeção. Quando introduzido com sucesso na cisterna lombar, o azul de tripano se liga à dura-máter, manchando o perímetro da medula e...

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Discussão

Uma grande variedade de doenças afeta o SNC. Fornecer uma cópia funcional do gene relevante por meio de um vetor viral é uma estratégia de tratamento atraente para aqueles que são recessivos e monogênicos por natureza, como atrofia muscular espinhal. No entanto, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui a maioria dos vetores de terapia gênica administrados por via intravenosa11. Aqueles que podem cruzar a BHE, como AAV9, devem ser administrados em altas doses para superar a perda vetorial devido à ...

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Divulgações

O Dr. Donsante é um inventor de uma patente pendente sobre a administração de vetores AAV9 no LCR.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman, da UT Southwestern, por uma discussão produtiva sobre o desafio representado por ratos juvenis para injeção intratecal. Este trabalho foi parcialmente apoiado por financiamento da Jaguar Gene Therapy (para JLFK).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
200 µ L pontas de pipeta filtradasMidSciPR-200RK-FLVírus de pipetagem
AAV9-GFPVector BuilderP200624-1005ynrAAV9 vetor expressando
sutura absorvível GFP com agulha revestida Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Círculo de corte reverso Tamanho da agulha 4 - 0 TrançadoMcKessonJ422HSutura
Bench padVWR56616-031Cirurgia
Almofadas Isotérmicas Braintree Scientific, 8'' x 8''FisherScientific50-195-4664Mantém a temperatura corporal
BuprenorfinaMcKesson1013922Analgésico
Buprenorfina-ER (1 mg/mL)ZoopharmaAnalgésico de liberação prolongada
CotonetesFisher Scientific19-365-409Remoção
de sangueDrapeado, Mouse, Plástico Transparente, 12" x 12", com Fenestração AdesivaSteris1212CPSTFCampo cirúrgico
Dumont #5 Forceps CobertorFerramentas Fine ScienceTools 11251-20Almofada
deAquecimento Extra Longa CVS Health
Eppendorf Research plus, pipeta de 1 canal, variável, 20; 200 µ LEppendorf3123000055Pipetting virus
Tesoura FinaFerramentas de Ciência Fina14059-11Tesoura cirúrgica curva
Ciência FinaFriedman-Pearson Rongeurs16121-14Laminectomia
Porta-agulhas HalseyFerramentas de Ciência Fina12001-13 Chave deagulha
Seringas de insulina com agulha ultrafina 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/ccSeringaBD 328431
IsofluranoMcKesson803250Toalhetes anestésicos
de isopropanolFisher Scientific22-031-350Desinfecção da pele
Lidocaína, 1%McKesson239935Anestesia local
Tubos de microcentrífuga: 1,5mLFisher Scientific05-408-137Carregando a seringa
IodopovidonaFisher Scientific50-118-0481 Cabo debisturi para desinfecção da pele
- #4Fine Science Tools10004-13Suporte de lâmina de bisturi
Sure-Seal InductionanestesiaBraintree ScientificEZ-17
Lâmina cirúrgica Miltex Carbon Steel No. 11 Estéril Descartável Embalada IndividualmenteMcKesson4-111#11 Lâmina de bisturi
SYSTANE Pomada para os olhos NIGHTTIMEAlconPomada para os olhos
Trypan BlueVWR97063-702Injeção
Elétrico de CVS Health Series 500Ferramentas de Chamber Caixa de

Referências

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