Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.
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Artigo de método
Estratégia para Biobanco de Organoides para Câncer de Ovário: Abordando a Heterogeneidade Interpaciente entre Subtipos Histológicos e Estágios da Doença
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora o estabelecimento de um biobanco de câncer de ovário a partir de organoides derivados de pacientes, juntamente com suas informações de antecedentes clínicos, prometa avanços na pesquisa e no cuidado ao paciente, a padronização permanece um desafio devido à heterogeneidade dessa malignidade letal, combinada com a complexidade inerente da tecnologia organoide. Este protocolo adaptável fornece uma estrutura sistemática para realizar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando uma variabilidade paciente-específica de progenitores. Ao implementar um fluxo de trabalho experimental estruturado para selecionar condições ideais de cultura e métodos de semeadura, com testes paralelos de semeadura 3D direta versus uma rota 2D/3D, obtemos, na maioria dos casos, linhas de expansão robustas de longo prazo adequadas para uma ampla gama de aplicações downstream.
Notavelmente, o protocolo tem sido testado e se mostrado eficiente em um grande número de casos (N = 120) de material de partida altamente heterogêneo, incluindo câncer de ovário de alto e baixo grau e estádios da doença com debulking primário, doença recorrente e espécimes cirúrgicos pós-neoadjuvantes. Dentro de um ambiente de sinalização exógena de baixo Wnt e alto BMP, observamos progenitores sendo diferentemente suscetíveis à ativação da via da Heregulina 1 ß (HERß-1), com o HERß-1 promovendo a formação de organoides em alguns enquanto o inibe em outros. Para um subconjunto das amostras do paciente, a formação ideal de organoides e o crescimento a longo prazo requerem a adição do fator de crescimento de fibroblastos 10 e R-Spondin 1 ao meio.
Além disso, destacamos as etapas críticas da digestão do tecido e do isolamento do progenitor e apontamos exemplos em que o breve cultivo em 2D em plástico é benéfico para a subsequente formação de organoides na matriz do Extrato de Membrana Basal tipo 2. Em geral, o biobanco ideal requer testes sistemáticos de todas as principais condições em paralelo para identificar um ambiente de crescimento adequado para linhas individuais. O protocolo também descreve o procedimento de manuseio para incorporação, secção e coloração eficientes para obter imagens de alta resolução de organoides, o que é necessário para uma fenotipagem abrangente.
Introdução
O manejo clínico de pacientes com câncer epitelial de ovário permanece desafiador devido à sua apresentação clínica heterogênea em estágios avançados e altas taxas derecorrência1. Melhorar nossa compreensão do desenvolvimento do câncer de ovário e do comportamento biológico requer abordagens de pesquisa que abordem a variabilidade específica do paciente durante o curso da doença, a resposta ao tratamento e as características histopatológicas e moleculares2.
O biobanco, caracterizado pela coleta sistemática e preservação a longo prazo de amostras tumorais derivadas de pacientes com câncer de ov....
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Protocolo
Espécimes de tecido tumoral de cirurgias de câncer de ovário foram coletados e organoides derivados da paciente foram gerados em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade LMU (17-471), aderindo aos regulamentos existentes aplicáveis da UE, nacionais e locais. Cada paciente envolvido no estudo consentiu por escrito. Ao trabalhar com amostras de tecido fresco, a permissão de segurança de Nível 2 de Biossegurança e os gabinetes de fluxo laminar são necessários. Dada a natureza potencialmente infecciosa das amostras de tecido, que não pode ser descartada devido à falta de testes de rotina de doenças infecciosas relevantes, é necessário garantir que as regulamenta....
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Resultados
Após dissociação, filtração e contagem inicial do tecido, as células são semeadas em paralelo diretamente no formato 3D, como explicado acima, bem como a suspensão no frasco para breve expansão 2D. Em alguns casos, a expansão 2D transitória influencia positivamente a formação do organoide, e a linha de longo prazo é estabelecida com sucesso por essa via, enquanto a semeadura 3D paralela comparativa pode resultar em parada de crescimento (Figura 1). Para cada tecido doador processado, as célu.......
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Discussão
O protocolo projetado aborda os desafios anteriores do biobanco de organoides do câncer de ovário no que diz respeito à formação de organoides e ao potencial de passagem a longo prazo e garante a geração de linhas totalmente expansíveis a partir da maioria dos depósitos tumorais sólidos. O processo de coleta cirúrgica de amostras tumorais a serem utilizadas para geração de organoides impacta significativamente o rendimento e o potencial de expansão. Amostras de tecido tumoral podem ser obtidas durante vários procedimento.......
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Divulgações
M.K. está listado como um inventor em uma patente relacionada a um meio para organoides de câncer de ovário. F.T. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários e despesas de viagem da AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA e Tesaro/GSK. S.M. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários ou despesas de viagem: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Agradecimentos
O estudo é financiado pelo Centro Alemão de Pesquisa do Câncer DKTK, parceiro de Munique, uma parceria entre a DKFZ e o Hospital Universitário LMU de Munique. O estudo também é apoiado pela bolsa alemã Cancer Aid (#70113426 e #70113433). A incorporação de parafina de tecidos e organoides foi realizada nas instalações do núcleo do Instituto de Anatomia, Faculdade de Medicina, LMU Munique, Munique. A Imagem Confocal foi realizada na instalação Core Bioimaging no Centro Biomédico (BMC). Os autores agradecem a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink e Martina Rahmeh pela ajuda técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Alemanha | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Alemanha | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R& D systems, Minneapolis, EUA | 3710-001-01 | Alternativa: Linha celular que expressa R-Spondin1, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Inibidor de quinase IV) | Merck, Darmstadt, Alemanha | 616454 | |
| Meio avançado DMEM/F-12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 12634028 | |
| Anticorpo anti-p53 (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA | sc-126 | |
| Anticorpo anti-PAX8 | Proteintech, Manchester, Reino Unido | 10336-1-AP | |
| B-27 Suplemento (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 17504-044 | |
| Filtro de aspirador de pó com tampa de garrafa 0.2 µ m | Corning, Berlim, Alemanha | ||
| Frasco de cultura de células CELLSTAR, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmü nster, Áustria | 661175 | |
| Balão de cultura de células CELLSTAR, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmü nster, Áustria | 690160 | |
| Balão de cultura de células CELLSTAR, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmü nster, Áustria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, EUA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlim, Alemanha | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell • Ciência Centrada no Ser Humano, Heidelberg, Alemanha | C-29912 | |
| Extrato de Membrana Basal com Fator de Crescimento Reduzido Cultrex, Tipo 2, Pathclear | R& D systems, Minneapolis, EUA | 3533-005-02 | Alternativa: Matrigel, Matriz de membrana basal reduzida por fator de crescimento Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Tampão de citrato, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, EUA | 62248 | |
| Burro anti coelho Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, EUA | A32794 | |
| Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, EUA | A32814 | |
| Dulbecco&agudo; s Solução salina tamponada com fosfato | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, EUA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon Poliestireno de 24 poços | Corning, Berlim, Alemanha | ||
| Bisturi de penas | Pfm medical, Colônia, Alemanha | 200130010 | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 10270106 | |
| Formalina 37% livre de ácido, estabilizado | Morphisto, Offenbach am Main, Alemanha | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | ||
| Anticorpo humano EpCAM / TROP-1 | R & D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| BMP2 recombinante humano | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Recombinante humano EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Heregulin beta-1 recombinante humano | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| Software LAS X core | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X Microscópio Confocal a Laser de Luz Branca | Leica Microsystems | ||
| N-2 Suplemento (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 17502-048 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Alemanha | 3570519 | |
| Parafilme de | |||
| Omnilab, Munique, Alemanha | 5170002 | ||
| Paraformaldeído | Morphisto, Offenbach am Main, Alemanha | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 15140-122 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µ m | PluriSelect, Leipzig, Alemanha | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, França | ant-pm-05 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Alemanha | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, EUA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemanha | T8154 | |
| Enzima TrypLE Express | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EUA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Alemanha | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Alemanha | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, EUA | R25001 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E....
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Reimpressões e permissões
