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Artigo de método

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

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DOI:

10.3791/66471

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5 de janeiro de 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Resumo

Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.

Introdução

Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos1. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.

Uma maneira comum de distinguir especificamente os processos celulares é por meio da manipulação genética. No entanto, as ferramentas disponíveis para estudos genéticos de A. baumannii são limitadas e, para confundir ainda mais o desenho experimental, isolados clínicos frequentemente são resistentes aos antibióticos rotineiramente usados para seleção em manipulações genéticas3. Um segundo obstáculo encontrado ao estudar especificamente bombas de efluxo é que elas são estritamente reguladas - muitas vezes por fatores desconhecidos - tornando difícil isolar com precisão e atribuir função a uma única bomba4. Vendo essa necessidade de expandir a caixa de ferramentas de pesquisa, desenvolvemos um sistema de expressão induzível baseado em mini-Tn7, de inserção de cópia única, que incorpora um Flp recombinase target (FRT), que permite a remoção do marcador de seleção 5,6,7 (Figura 1). Criado primeiramente para Pseudomonas 8,9,10, este elegante sistema de clonagem e expressão foi usado para gerar complementos de bomba de efluxo de cópia única em uma cepa deficiente em bomba de efluxo RND de A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: doravante referida como A. baumannii AB258) que geramos11. Sendo capaz de estudar uma bomba de efluxo de cada vez e não sobrecarregar as células bacterianas com alta expressão de cópia (como geralmente visto com sistemas de expressão baseados em plasmídeos), pode-se aprender melhor sobre os aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de efluxo com interferência mínima e complicações reduzidas.

Este artigo descreve como usar o sistema mini-Tn7 para complementar um gene excluído de interesse, a bomba de efluxo de RND adeIJK, no cromossomo de A. baumannii AB258 através de uma série de etapas não complicadas realizadas ao longo de 9 dias7. O primeiro conjunto de etapas reintroduz os genes deletados da bomba de efluxo clonados no plasmídeo de inserção baseado em mini-Tn7 (Figura 2A) no único sítio de inserção attTn7 a jusante do gene glmS bem conservado (Figura 3A). Esse processo é facilitado por um plasmídeo auxiliar não replicativo (Figura 2B) que codifica os genes de transposase necessários para a inserção impulsionada por Tn7. O segundo conjunto de etapas utiliza um plasmídeo de excisão (Figura 2C) para a remoção mediada pela recombinase de Flp do gene da gentamicina flanqueado por sítios de TAF (Figura 3B) para criar uma cepa não marcada. Embora esse sistema seja usado para elucidar os papéis essenciais e possíveis inibidores das bombas de efluxo de RND com relação à resistência a antibióticos, ele pode ser usado para investigar qualquer gene de interesse.

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Protocolo

1. Preparação experimental

  1. Purificar o plasmídeo pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plasmídeo de inserção, Figura 2A) com o gene de interesse.
    NOTA: Aqui, o gene de interesse é adeIJK. A concentração final do plasmídeo deve ser de ≥100 ng/μL.
  2. Purificar o plasmídeo auxiliar (pTNS2)9 e o plasmídeo de excisão (pFLP2ab)6 (Figura 2B,C, respectivamente), idealmente para uma concentração final de DNA plasmidial de ≥100 ng/μL.
  3. Preparar 50 mL de água ultrapura estéril e 25 mL de caldo LB estéril (Lennox) (ver Tabela de Materiais).
  4. Preparar um mínimo de 10 placas de ágar LB, cada uma com os seguintes aditivos: simples (sem aditivos), gentamicina (Gm) a 50 μg/ml, carbenicilina (Cb) a 200 μg/ml (para selecção através do gene de resistência à ampicilina) e sacarose a 5% (ver Tabela de Materiais).
  5. Esticar a cepa a ser usada para inserção em ágar LB e incubar a 37 °C por 16-18 h. Aqui, A. baumannii AB258 é usado.
    NOTA: Este protocolo deve ser realizado em um ambiente estéril, tanto quanto possível, usando um queimador de Bunsen na bancada ou um armário de segurança biológica. Todos os consumíveis (pontas de pipeta, laços de inoculação, tubos de microfuga, etc.) precisam ser estéreis.

2. Preparação da cultura

  1. Inocular uma única colônia de A. baumannii AB258 em 4 mL de caldo LB em um tubo de cultura estéril de 13 mL usando uma alça de inoculação estéril ou bastão de inoculação de madeira estéril.
    NOTA: Uma única cultura de 4 mL é usada para uma amostra e um controle. Aumentar o número de culturas em função do número de amostras necessárias.
  2. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação (250 rpm).
  3. Coloque um frasco de água destilada estéril (25-50 ml) a 4 °C durante a noite para utilização no passo 3.

3. Preparação de células eletrocompetentes

  1. Colocar todos os tubos de microfuga estéreis de 1,5 mL (dois por cultura) e cubetas de eletroporação estéreis (dois por cultura) no gelo (ver Tabela de Materiais). Mantenha as amostras no gelo o máximo possível durante todo o procedimento.
  2. Coloque o frasco de água estéril que foi armazenado a 4 °C sobre gelo.
  3. Transfira 1,5 mL da cultura bacteriana noturna para um dos tubos de microfuge de 1,5 mL.
  4. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min para pellet as células.
    NOTA: A centrifugação seria idealmente realizada a 4 °C, mas a centrifugação à temperatura ambiente é aceitável e não prejudicial.
  5. Usando uma pipeta de 1 mL, remova todo o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
  6. Adicione mais 1,5 mL de cultura bacteriana no mesmo tubo de microfuga. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min e, em seguida, remover todo o sobrenadante.
  7. Repetir o passo 3,6 uma última vez com o 1 mL restante de cultura.
  8. Adicione 1 mL de água estéril gelada ao pellet de célula e ressuspenda com pipetagem suave até que o pellet não fique mais no fundo do tubo de microfuga.
  9. Centrifugar as células ressuspensas a 13.000 x g por 2 min.
  10. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL. Não despeje o sobrenadante, especialmente nas etapas de lavagem subsequentes, quando as células tendem a formar pellets menos compactos.
  11. Repita esta etapa de lavagem com água estéril gelada, passos 3.8 para passo 3.10, mais duas vezes.
  12. Ressuspenda suavemente o pellet de célula final em 200 μL de água estéril gelada.
  13. Transferir 100 μL da suspensão celular final para o segundo tubo de microfuga gelado de 1,5 mL. Esta segunda alíquota se tornará o controle negativo para eletroporação. Mantenha as amostras de células no gelo.

4. Eletroporação

  1. Pré-aquecer 1 mL de caldo LB e uma placa de ágar LB + Gm50 (preparada na etapa 1.4) para cada amostra e controle em uma estufa estática regulada para 37 °C.
  2. Em um volume combinado de 5 μL ou menos, adicione 100-200 ng cada um dos plasmídeos auxiliares pTNS2 e o plasmídeo de inserção pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a uma alíquota de células eletrocompetentes.
  3. Misture com batidas suaves na ponta dos dedos para garantir a mistura completa dos plasmídeos com as células eletrocompetentes sem introduzir bolhas.
  4. Adicione um volume equivalente de água destilada estéril na alíquota da célula de controle negativo e misture delicadamente como acima.
  5. Incubar as amostras no gelo por 20 min.
  6. Transfira toda a amostra de células para uma cubeta de eletroporação gelada e, em seguida, coloque a cubeta de volta no gelo. Repita para a amostra de célula de controle negativa.
  7. Eletroporar a amostra celular.
    1. Ligue o eletroporador e regule-o para 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (consulte Tabela de Materiais).
    2. Limpe a superfície da cubeta com um tecido macio para remover qualquer gelo ou umidade aderente.
    3. Insira a cubeta no eletroporator e dê o choque elétrico.
    4. Adicione imediatamente 0,9 mL de caldo LB pré-aquecido às células da cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar as células com o meio.
    5. Transfira toda a suspensão celular para um novo tubo de microfuga de 1,5 mL (temperatura ambiente).
    6. Verifique o valor da constante de tempo no eletroporador; Para melhores resultados, esse valor deve estar entre 4 e 6.
  8. Repetir o procedimento de electroporação (passos 4.7.1 a passo 4.7.6) para a amostra de células de controlo negativas.
  9. Incubar as amostras electroporadas a 37 °C durante 1 h a 250 rpm para permitir a recuperação celular.
  10. Usando um espalhador de inoculação, espalhe 100 μL de cada amostra de célula eletroporada em uma placa de ágar LB + Gm50 pré-aquecida.
    1. Centrifugar as amostras restantes a 13.000 x g por 2 min para peletizar as células.
    2. Após a remoção de todo o sobrenadante com pipeta, ressuspenda as células em 100 μL de caldo LB.
    3. Espalhe cada amostra inteira em placas individuais de ágar LB + Gm50 pré-aquecidas.
      NOTA: A eficiência da eletroporação pode ser dependente da deformação. Ao eletroporar uma cepa pela primeira vez, pode ser informativo plaquear diferentes volumes, ou mesmo diluições, da amostra de eletroporação para garantir que as placas resultantes tenham colônias isoladas.
  11. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.

5. Seleção de colônias transformadas para triagem baseada em PCR

  1. Verifique as placas de eletroporação. O controle negativo não deve ter colônias; a amostra deve ter colônias distintas.
    NOTA: As placas com colónias, nesta etapa e em todas as etapas subsequentes em que são produzidas placas de ágar com colónias ou remendos, podem ser armazenadas a 4 °C até 3 dias antes de prosseguir.
  2. Usando palitos estéreis, pegue até 10 colônias únicas das placas de ágar LB + Gm50 e remende-as em uma placa de ágar LB + Gm50 fresca.
  3. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.

6. Verificação da inserção cromossômica por PCR de colônias

  1. Remova as placas de ágar LB + Gm50 contendo as colônias remendadas da incubadora.
  2. Usando um palito estéril ou ponta de pipeta estéril, remova uma pequena porção (aproximadamente do tamanho de uma colônia grande) de um adesivo em 20 μL de água destilada estéril em um tubo de PCR de 0,2 mL; misture bem. A amostra de água deve ficar visivelmente turva à medida que as células são liberadas do palito. Prepare qualquer número de amostras que precisem ser examinadas, mas 6 devem ser suficientes.
  3. Incubar o tubo de PCR contendo a suspensão bacteriana a 100 °C durante 5-10 min.
  4. Usando uma minicentrífuga (ver Tabela de Materiais), gire a amostra na velocidade máxima fixa por 2 min para pellet de detritos celulares.
  5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR de 0,2 mL e coloque-o no gelo. Esta amostra contém o DNA do molde para a reação de PCR.
    NOTA: Este modelo de DNA pode ser armazenado a -20 °C antes de prosseguir com a PCR.
  6. Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New primer para frente, 0,18 μM Tn7R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Prepare um controle sem modelo (NTC), incluindo todos, exceto o DNA do modelo (consulte Tabela de Materiais).
  7. Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 49 °C por 30 s e 72 °C por 30 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.
  8. Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 2% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 382 pb. O NTC não deve ter bandas.
  9. Identificar as amostras que produziram o produto PCR esperado. Preparar uma placa de estria em placas de ágar LB + Gm50 a partir de qualquer um dos adesivos positivos para PCR; incubar a 37 °C durante 16-18 h. O objetivo é gerar uma placa com colônias únicas para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa marcada e como ponto de partida para a criação de uma cepa não marcada (descrita abaixo).

7. Remoção do marcador GmR usando pFLP2ab

  1. Siga o procedimento mencionado na etapa 2: Preparação da cultura. A amostra utilizada para o preparo da cultura noturna é uma única colônia a partir das placas de ágar LB + Gm50 preparadas para gerar colônias discretas na etapa 6.9.
  2. Siga o procedimento mencionado na etapa 3: Preparação de células eletrocompetentes. Preparar as células da cultura noturna para eletroporação.
  3. Siga o procedimento mencionado no passo 4: Eletroporação. Aqui, o plasmídeo a ser introduzido nas células é o pFLP2ab (100-200 ng), que removerá o gene de resistência à gentamicina, flanqueando o gene cromossomicamente inserido de interesse.
  4. Após a recuperação das células durante 1 h (passo 4.9), espalhar 100 μL da amostra celular electroporada numa placa de ágar LB + Cb200 pré-aquecida (preparada no passo 1.4). Essa pressão seletiva garante que apenas as células que abrigam o plasmídeo de excisãoab pFLP2 cresçam.
  5. Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.
  6. Verifique a placa para colônias. A placa de controle negativo não deve ter colônias; a placa de amostra de ágar LB + Cb200 deve ter colônias distintas.
  7. Usando palitos estéreis, remende até 20 colônias isoladas em uma placa de ágar LB + Cb200 e uma placa de ágar LB + Gm50 .
  8. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
  9. Verifique se há remendos nas placas. Clones que crescem na placa de ágar LB + Cb200 , mas não na placa de ágar LB + Gm50 , tiveram o gene de resistência à gentamicina removido da inserção original.
  10. Selecionar as manchas resistentes à carbenicilina e suscetíveis à gentamicina para serem usadas em placas individuais de ágar LB suplementadas com 5% (p/v) de sacarose, o que força a expulsão do plasmídeoab pFLP2 da bactéria. Escolha até 10 colônias.
  11. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
  12. Verifique as placas para colônias.
  13. Como confirmação final da perda de pFLP2ab plasmidial, o patch cruzado 4-6 isolou colônias das placas de sacarose a 5% em uma placa de ágar LB + Cb200 e uma placa de ágar LB.
  14. Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.
  15. Escolha um clone que esteja crescendo na placa de ágar LB, e que seja sensível à carbenicilina para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa não marcada.
    1. A verificação genética da cepa não marcada pode ser realizada com PCR de colônia (passo 6: Verificando a inserção cromossômica por PCR de colônia) usando os primers que têm como alvo o gene de resistência à gentamicina.
    2. Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM Gm_F primer para frente, 0,18 μM Gm_R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Preparar um controle sem modelo (NTC) incluindo todos, exceto o DNA do modelo, e um controle positivo usando DNA da cepa marcada.
    3. Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 50 °C por 30 s e 72 °C por 40 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.
    4. Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 1% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 525 pb. O controle positivo deve ter uma única banda; as amostras e o NTC não devem ter bandas.

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Resultados

O procedimento de inserção cromossômica leva apenas 2 h no total ao longo de 3 dias para ver um resultado-colônias crescendo em uma placa de ágar seletiva (Figura 1A-C). O número esperado de colônias na placa de transformação é dependente da deformação: pode-se ver 20-30 ou mesmo centenas de colônias, pois a inserção de Tn7 nos sítios attTn7 é específica eeficiente9. O patch das colônias da placa de transformação em meios sel...

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Discussão

Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifugação à temperatura ambie...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá para AK. Os esquemas utilizados nas figuras são criados com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de PCR de 0,2 mLVWR20170-012Para preparações de fervura de colônias e reações de PCR
Tubos de microfuga de 1,5 mLSarstedt72-690-301
Tubos de cultura de 13 mL de uso geral, PyrexFisher14-957KVasos de cultura líquida
6x tampão de carregamento de DNAFroggabioLD010Corante de carregamento de amostra de eletroforese em gel de agarose
Acético ácido, glacialFisher351271-212Componente de tampão de corrida de gel de agarose
AgarBioshopAGR003Meio de crescimento sólido
AgaroseBioBasicD0012Separação eletroforética de produtos de reação de PCR; usado em uma concentração de 0,8– Unidade
eletroforese em gel de agaroseFisher29-237-54Eletroforese em gel de agarose; separação de produtos de reação de PCR
CarbenicilinaFisher50841231Meios seletivos
Tampas de tubos de culturaFisher13-684-138Fechamento de aço inoxidável para tubos de cultura de 13 mL Conjunto
trifosfato de desoxinucleotídeo (dNTP) BiobasicDD0058componente de reação de PCR; fornecido como 100 mM cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP; misturado e diluído para 10 mM cada dNTP
Aquecedor de banho/bloco secoFisher88860023Isotemp banho seco digital para preparações de fervura
Cubetas de eletroporaçãoVWR89047-208Cuvetes de eletroporação de 2 mm com tampa redonda
EletroporadorCole Parmer940000009110 VAC, 60 Hz eletroporador
Brometo de etídioFisherBP102-1Visualização de produtos de reação de PCR e marcador de ADN em gel de agarose
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)VWRCA-EM4050Gel de agarose componente tampão de corrida
GentamicinaBiobasicGB0217Para a preparação de meios seletivos
GlicerolFisherG33Preparação de estoques bacterianos para armazenamento de longo prazo em um freezer ultrabaixo
Incubadora (agitação)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Incubadora Agitador para crescimento de cultura líquida
Incubadora (estática)Fisher11-690-550DIsotemp Incubadora Forno Modelo 550D para crescimento de cultura sólida (ágar LB)
Alça de inoculaçãoSarstedt86.1562.050Colônias de listras em placas de ágar
Espalhador de inoculaçãoSarstedt86.1569.005Espalhamento de cultura em placas de ágar
Caldo de lisogenia (LB) caldo, LennoxFisherBP1427Meios de crescimento líquidos (20 g/L: 5 g/L de cloreto de sódio, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura)
MicrofugaFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 para centrifugação de amostras
Mini-centrífugaFisherS67601BCentrifugação de tubos de PCR de 0,2 mL Placas de Petri
SPL Life Sciences10090Para meios de crescimento sólidos (placas de ágar): 90 x 15 mm
Pipetas MandelVáriaspipetas de canal único Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Fonte de alimentaçãoBiorad1645050PowerPac Fonte de alimentação básica para eletroforese
Primers Componente deIDTNAPCR; específico para o gene de interesse; preparado a 100 μ M conforme indicado na folha de especificações do produto
SucroseBioBasicSB0498Para a preparação de meios contra-seletivos para remoção do plasmídeo pFLP2ab de A. baumannii
Taq DNA polimeraseFroggaBioT-500Componente de reação PCR; polimerase fornecida com um termociclador 10x tampão
Biorad1861096Modelo T100 para PCR
Palitos de denteFisherS24559Para remendar colônias em placas de ágar
Base Trizma SigmaT1503Componente de tampão de execução de gel de agarose
Água ultrapuraMillipore SigmaZLXLSD51040Sistema de purificação de água MilliQ: água ultra pura para preparação de meios e soluções e lavagem de células
Marcador de DNA de ampla gamaBiobasicM103R-2Determinação do tamanho de produtos de PCR em um gel de agarose
Varas de inoculação de madeiraFisher29-801-02Inoculação de culturas com colônias de placas de ágar
de 2% de reação

Referências

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  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
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  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
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