Test de complémentation basé sur Escherichia coli pour étudier la fonction chaperonne de la protéine de choc thermique 70
Summary
Ce protocole démontre l’activité chaperonne de la protéine de choc thermique 70 (Hsp70). Les cellules E. coli dnaK756 servent de modèle pour le test car elles hébergent un Hsp70 natif et fonctionnellement altéré, ce qui les rend sensibles au stress thermique. L’introduction hétérologue de Hsp70 fonctionnel sauve le déficit de croissance des cellules.
Abstract
La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est une protéine conservée qui facilite le repliement d’autres protéines dans la cellule, ce qui en fait un chaperon moléculaire. Bien que Hsp70 ne soit pas essentiel à la croissance des cellules E. coli dans des conditions normales, ce chaperon devient indispensable pour la croissance à des températures élevées. Comme Hsp70 est hautement conservé, une façon d’étudier la fonction chaperon des gènes Hsp70 de diverses espèces est de les exprimer de manière hétérologue dans des souches d’E. coli qui sont soit déficientes en Hsp70, soit expriment une Hsp70 native qui est fonctionnellement compromise. Les cellules E. coli dnaK756 sont incapables de supporter l’ADN bactériophage λ. De plus, leur Hsp70 natif (DnaK) présente une activité ATPase élevée tout en démontrant une affinité réduite pour GrpE (facteur d’échange nucléotidique Hsp70). En conséquence, les cellules E. coli dnaK756 se développent correctement à des températures allant de 30 °C à 37 °C, mais elles meurent à des températures élevées (>40 °C). Pour cette raison, ces cellules servent de modèle pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’application de ces cellules afin de réaliser un test de complémentation, permettant d’étudier la fonction chaperonne in cellulo de Hsp70.
Introduction
Les protéines de choc thermique jouent un rôle important en tant que chaperons moléculaires en facilitant le repliement des protéines, en empêchant l’agrégation des protéines et en inversant le mauvais repliement des protéines 1,2. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est l’un des chaperons moléculaires les plus importants, jouant un rôle central dans l’homéostasie des protéines 3,4. DnaK est l’homologue5 d’E. coli Hsp70.
Divers tests biophysiques, biochimiques et cellulaires ont été mis au point pour explorer l’activité chaperonne de Hsp70 et pour dépister les inhibiteurs ciblant ce chaperon 6,7,8. Hsp70 est une protéine hautement conservée. Pour cette raison, plusieurs Hsp70 d’organismes eucaryotes, tels que Plasmodium falciparum (le principal agent du paludisme), ont été signalés comme substituant la fonction DnaK chez E. coli 6,9. De cette manière, un test de complémentation basé sur E. coli a été développé impliquant l’expression hétérologue de Hsp70s chez E. coli pour explorer leur fonction cytoprotectrice. En règle générale, ce test implique l’utilisation de cellules E. coli qui sont soit déficientes pour le DnaK, soit qui expriment un DnaK natif qui est fonctionnellement compromis. Bien que le DnaK ne soit pas essentiel à la croissance d’E. coli dans des conditions normales, il devient essentiel lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions stressantes telles que des températures élevées ou d’autres formes de stress10,11.
Les souches d’E. coli qui ont été développées pour étudier la fonction de Hsp70 à l’aide d’un test de complémentation comprennent E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr ::Tn10]) et E. coli dnaK756. Les cellules dnaK103 d’E. coli produisent un DnaK tronqué qui n’est pas fonctionnel, et en tant que tel, les cellules se développent correctement à 30 °C, tandis que la souche est sensible au stress dû au froid et à la chaleur12,13. De même, la souche E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA ::TcR Pdm1,1) ne se développe pas au-dessus de 40 °C14,15. La souche E. coli dnaK756 exprime un DnaK natif mutant (DnaK756) caractérisé par trois substitutions glycine-aspartate aux positions 32, 455 et 468, donnant lieu à des résultats protéostatiques compromis. Par conséquent, cette souche est résistante au bactériophage λ ADN14. De plus, E. coli dnaK756 présente une activité ATPase élevée, tandis que son affinité pour le facteur d’échange nucléotidique, GrpE, est réduite16. E. coli Les souches mutantes DnaK servent de modèles idéaux pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70 par une approche de complémentation. Comme le DnaK n’est essentiel que dans des conditions stressantes, le test de complémentation est généralement effectué à des températures élevées (Figure 1). Parmi les avantages de l’utilisation d’E. coli pour cette étude, citons son génome bien caractérisé, sa croissance rapide et le faible coût de culture et d’entretien17.
Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole impliquant l’utilisation de cellules E. coli dnaK756 pour étudier la fonction de Hsp70. Les Hsp70 que nous avons utilisés dans le test sont des DnaK de type sauvage et son dérivé chimérique, KPf (composé du domaine ATPase de DnaK fusionné au domaine de liaison au substrat C-terminal de Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F a été exprimé de manière hétérologue comme un contrôle négatif puisque la mutation l’empêche essentiellement de se lier aux substrats, abrogeant ainsi son activité chaperonne9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole démontre l’utilité des cellules E. coli dnaK756dans l’exploration de la fonction chaperon de Hsp70 exprimée de manière hétérologue. Ce test pourrait être adopté pour cribler les inhibiteurs ciblant la fonction de Hsp70 dans le cellulo. Cependant, l’une des limites de cette méthode est que les Hsp70 incapables de remplacer le DnaK dans E. coli ne sont pas compatibles avec ce test. L’absence de modification post-traductionnelle21 de certains H…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par une subvention obtenue du Centre international pour le génie génétique et la biotechnologie (ICGEB) numéro de subvention HDI/CRP/012, Direction de la recherche de l’Université de Venda, subvention I595, Département de la science et de l’innovation (DSI) et Fondation nationale de la recherche (NRF) d’Afrique du Sud (numéros de subvention, 75464 et 92598) accordée à AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
