Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70
Summary
Dieses Protokoll zeigt die Chaperon-Aktivität des Hitzeschockproteins 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-Zellen dienen als Modell für den Assay, da sie ein natives, funktionell beeinträchtigtes Hsp70 beherbergen, was sie anfällig für Hitzestress macht. Die heterologe Einführung von funktionellem Hsp70 rettet die Wachstumsschwäche der Zellen.
Abstract
Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist ein konserviertes Protein, das die Faltung anderer Proteine innerhalb der Zelle erleichtert und es zu einem molekularen Chaperon macht. Während Hsp70 für das Wachstum von E. coli-Zellen unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, wird dieses Chaperon für das Wachstum bei erhöhten Temperaturen unverzichtbar. Da Hsp70 hochkonserviert ist, besteht eine Möglichkeit, die Chaperonfunktion von Hsp70-Genen verschiedener Arten zu untersuchen, darin, sie heterolog in E. coli-Stämmen zu exprimieren, die entweder einen Mangel an Hsp70 aufweisen oder ein natives Hsp70 exprimieren, das funktionell beeinträchtigt ist. E. coli dnaK756-Zellen sind nicht in der Lage, λ-Bakteriophagen-DNA zu unterstützen. Darüber hinaus weist ihr natives Hsp70 (DnaK) eine erhöhte ATPase-Aktivität auf, während sie eine reduzierte Affinität zu GrpE (Hsp70-Nukleotidaustauschfaktor) aufweist. Infolgedessen wachsen E. coli dnaK756-Zellen bei Temperaturen zwischen 30 °C und 37 °C ausreichend, sterben jedoch bei erhöhten Temperaturen (>40 °C) ab. Aus diesem Grund dienen diese Zellen als Modell für die Untersuchung der Chaperonaktivität von Hsp70. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung dieser Zellen zur Durchführung eines Komplementationsassays, der die Untersuchung der In-Cellulo-Chaperon-Funktion von Hsp70 ermöglicht.
Introduction
Hitzeschockproteine spielen eine wichtige Rolle als molekulare Chaperone, indem sie die Proteinfaltung erleichtern, die Proteinaggregation verhindern und die Fehlfaltung von Proteinen umkehren 1,2. Das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist eines der bekanntesten molekularen Chaperone und spielt eine zentrale Rolle bei der Proteinhomöostase 3,4. DnaK ist das E. coli Hsp70-Homolog5.
Verschiedene biophysikalische, biochemische und zellbasierte Assays wurden entwickelt, um die Chaperon-Aktivität von Hsp70 zu untersuchen und nach Inhibitoren zu suchen, die auf dieses Chaperon abzielen 6,7,8. Hsp70 ist ein hochkonserviertes Protein. Aus diesem Grund wurde berichtet, dass mehrere Hsp70 eukaryotischer Organismen, wie Plasmodium falciparum (der Haupterreger der Malaria), die DnaK-Funktion in E. coliersetzen 6,9. Auf diese Weise wurde ein E. coli-basierter Komplementationsassay entwickelt, der die heterologe Expression von Hsp70s in E. coli beinhaltet, um ihre zytoprotektive Funktion zu untersuchen. Typischerweise beinhaltet dieser Assay die Verwendung von E. coli-Zellen, die entweder einen Mangel an DnaK aufweisen oder ein natives DnaK exprimieren, das funktionell beeinträchtigt ist. Während DnaK für das Wachstum von E. coli unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, wird es essentiell, wenn die Zellen unter Stressbedingungen wie erhöhten Temperaturen oder anderen Formen von Stress gezüchtet werden10,11.
Zu den E. coli-Stämmen, die entwickelt wurden, um die Funktion von Hsp70 mit einem Komplementationsassay zu untersuchen, gehören E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) und E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-Zellen produzieren ein verkürztes DnaK, das nicht funktionsfähig ist, und als solches wachsen die Zellen bei 30 °C ausreichend, während der Stamm empfindlich auf Kälte- und Hitzestress reagiert12,13. Ebenso wächst der Stamm E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) nicht über 40 °C14,15. Der E. coli dnaK756-Stamm exprimiert ein mutiertes natives DnaK (DnaK756), das durch drei Glycin-Aspartat-Substitutionen an den Positionen 32, 455 und 468 gekennzeichnet ist, was zu beeinträchtigten proteostatischen Ergebnissen führt. Folglich ist dieser Stamm resistent gegen Bakteriophagen-λ-DNA14. Darüber hinaus weist E. coli dnaK756 eine erhöhte ATPase-Aktivität auf, während seine Affinität zum Nukleotidaustauschfaktor GrpE reduziert ist16. E. coli DnaK-Mutantenstämme dienen als ideale Modelle, um die Chaperonaktivität von Hsp70 durch einen Komplementationsansatz zu untersuchen. Da DnaK nur unter Stressbedingungen essentiell ist, wird der Komplementationsassay typischerweise bei erhöhten Temperaturen durchgeführt (Abbildung 1). Zu den Vorteilen der Verwendung von E. coli für diese Studie gehören das gut charakterisierte Genom, das schnelle Wachstum und die geringen Kosten für Kultivierung und Wartung17.
In diesem Artikel beschreiben wir detailliert ein Protokoll, bei dem E. coli dnaK756-Zellen verwendet werden, um die Funktion von Hsp70 zu untersuchen. Die Hsp70s, die wir im Assay verwendet haben, sind Wildtyp-DnaK und sein chimäres Derivat KPf (bestehend aus der ATPase-Domäne von DnaK, die mit der C-terminalen Substratbindungsdomäne von Plasmodium falciparum Hsp70-1 fusioniertist 6,18). KPf-V436F wurde heterolog als Negativkontrolle exprimiert, da die Mutation es im Wesentlichen daran hindert, Substrate zu binden, wodurch seine Chaperonaktivität aufgehobenwird 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll demonstriert den Nutzen von E. coli dnaK756-Zellenbei der Erforschung der Chaperonfunktion von heterolog exprimiertem Hsp70. Dieser Assay könnte zum Screening von Inhibitoren eingesetzt werden, die auf die Hsp70-Funktion in Cellulo abzielen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht jedoch darin, dass Hsp70s, die DnaK in E. coli nicht ersetzen können, mit diesem Assay nicht kompatibel sind. Das Fehlen einer posttranslationalen Modifikation21 einiger nich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde mit Zuschüssen des International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) Fördernummer HDI/CRP/012, Forschungsdirektion der Universität Venda, Zuschuss I595, Department of Science and Innovation (DSI) und der National Research Foundation (NRF) von Südafrika (Fördernummern 75464 und 92598) unterstützt, die an AS vergeben wurden.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
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