यह प्रोटोकॉल हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) की चैपरोन गतिविधि को प्रदर्शित करता है। ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाएं परख के लिए एक मॉडल के रूप में काम करती हैं क्योंकि वे एक देशी, कार्यात्मक रूप से बिगड़ा हुआ Hsp70 को बंद करते हैं, जिससे वे गर्मी के तनाव के लिए अतिसंवेदनशील हो जाते हैं। कार्यात्मक एचएसपी 70 का विषम परिचय कोशिकाओं की वृद्धि की कमी को बचाता है।
हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) एक संरक्षित प्रोटीन है जो कोशिका के भीतर अन्य प्रोटीनों को मोड़ने की सुविधा प्रदान करता है, जिससे यह आणविक संरक्षक बन जाता है। जबकि एचएसपी 70 सामान्य परिस्थितियों में बढ़ने वाली ई कोलाई कोशिकाओं के लिए आवश्यक नहीं है, यह चैपरोन ऊंचे तापमान पर विकास के लिए अपरिहार्य हो जाता है। चूंकि Hsp70 अत्यधिक संरक्षित है, विभिन्न प्रजातियों से Hsp70 जीन के चैपरोन फ़ंक्शन का अध्ययन करने का एक तरीका यह है कि उन्हें E. coli उपभेदों में विषम रूप से व्यक्त किया जाए जो या तो Hsp70 में कमी रखते हैं या एक देशी Hsp70 को व्यक्त करते हैं जो कार्यात्मक रूप से समझौता किया जाता है। ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाएं λबैक्टीरियोफेज डीएनए का समर्थन करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, उनके मूल Hsp70 (DnaK) GrpE (Hsp70 न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर) के लिए कम आत्मीयता का प्रदर्शन करते हुए उन्नत ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है। नतीजतन, ई. कोलाई डीएनएके 756 कोशिकाएं 30 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर पर्याप्त रूप से बढ़ती हैं, लेकिन वे ऊंचे तापमान (>40 डिग्री सेल्सियस) पर मर जाती हैं। इस कारण से, ये कोशिकाएं एचएसपी 70 की चैपरोन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में काम करती हैं। यहां, हम एक पूरक परख का संचालन करने के लिए इन कोशिकाओं के आवेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एचएसपी70के सेल्यूलो चैपरोन फ़ंक्शन के अध्ययन को सक्षम करता है।
हीट शॉक प्रोटीन प्रोटीन तह की सुविधा के द्वारा आणविक चैपरोन के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने, और प्रोटीन misfolding 1,2 उलट कर. हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) सबसे प्रमुख आणविक चैपरोन में से एक है, जो प्रोटीन होमियोस्टेसिस 3,4 में केंद्रीय भूमिका निभा रहा है। DnaK ई कोलाई Hsp70 homologue5 है।
विभिन्न biophysical, जैव रासायनिक, और सेल आधारित assays Hsp70 के chaperone गतिविधि का पता लगाने के लिए और इस चैपरोन 6,7,8 को लक्षित अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया है. एचएसपी 70 एक अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन है। इस कारण से, यूकेरियोटिक जीवों के कई Hsp70s, जैसे प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम (मलेरिया का मुख्य एजेंट), ई. कोलाई 6,9में DnaK फ़ंक्शन के विकल्प के लिए सूचित किया गया है। इस तरह, एक ई कोलाई-आधारित पूरक परख विकसित की गई है जिसमें ई कोलाई में एचएसपी 70 के विषम अभिव्यक्ति को शामिल किया गया है ताकि उनके साइटोप्रोटेक्टिव फ़ंक्शन का पता लगाया जा सके। आमतौर पर, इस परख में ई कोलाई कोशिकाओं का उपयोग शामिल होता है जो या तो डीएनएके के लिए कमी होती हैं या जो एक देशी डीएनएके व्यक्त करती हैं जो कार्यात्मक रूप से समझौता किया जाता है। जबकि DnaK सामान्य परिस्थितियों में ई कोलाई विकास के लिए आवश्यक नहीं है, यह आवश्यक हो जाता है जब कोशिकाओं को इस तरह के ऊंचा तापमान या तनाव10,11 के अन्य रूपों के रूप में तनावपूर्ण परिस्थितियों में उगाया जाता है.
ई. कोलाई उपभेदों है कि एक पूरक परख का उपयोग कर Hsp70 समारोह का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है ई कोलाई dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr::Tn10]) और ई कोलाई dnaK756 शामिल हैं. ई कोलाई dnaK103 कोशिकाओं गैर कार्यात्मक है कि एक काटे DnaK उत्पादन, और इस तरह, कोशिकाओं 30 डिग्री सेल्सियस पर पर्याप्त रूप से विकसित, जबकि तनाव ठंड और गर्मीतनाव 12,13 के प्रति संवेदनशील है. इसी तरह, ई. कोलाई dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) तनाव 40 डिग्री सेल्सियस14,15 से ऊपर नहीं बढ़ता है। ई. कोलाई dnaK756 तनाव एक उत्परिवर्ती देशी DnaK व्यक्त करता है (DnaK756) 32, 455, और 468 पदों पर तीन ग्लाइसिन-टू-एस्पेरेट प्रतिस्थापन की विशेषता, समझौता प्रोटियोस्टेटिक परिणामों को जन्म दे. नतीजतन, यह तनाव बैक्टीरियोफेज λ डीएनए14 के लिए प्रतिरोधी है। इसके अतिरिक्त, ई. कोलाई dnaK756 ऊंचा ATPase गतिविधि को प्रदर्शित करता है, जबकि न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक, GrpE के लिए इसकी आत्मीयता16 कम हो जाती है। ई. कोलाई DnaK उत्परिवर्ती उपभेद एक पूरक दृष्टिकोण के माध्यम से Hsp70 की चैपरोन गतिविधि की जांच के लिए आदर्श मॉडल के रूप में काम करते हैं। चूंकि DnaK केवल तनावपूर्ण परिस्थितियों में आवश्यक है, पूरक परख आमतौर पर ऊंचा तापमान(चित्रा 1)पर आयोजित की जाती है। इस अध्ययन के लिए ई कोलाई का उपयोग करने के कुछ फायदे इसकी अच्छी तरह से विशेषता जीनोम, तेजी से विकास, और संवर्धन और रखरखाव17 की कम लागत शामिल हैं.
इस लेख में, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एचएसपी 70 के कार्य का अध्ययन करने के लिए ई कोलाई डीएनएके 756 कोशिकाओं का उपयोग शामिल है। परख में हमारे द्वारा नियोजित Hsp70s जंगली-प्रकार DnaK और इसके काइमेरिक व्युत्पन्न, KPf (प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम Hsp70-1 6,18 के सी-टर्मिनल सब्सट्रेट-बाइंडिंग डोमेन से जुड़े DnaK के ATPase डोमेन से बना है)। KPf-V436F विषम रूप से एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में व्यक्त किया गया था क्योंकि उत्परिवर्तन अनिवार्य रूप से इसे बाध्यकारी सब्सट्रेट से अवरुद्ध करता है, इस प्रकार इसकी चैपरोन गतिविधि9 को निरस्त कर देता है।
प्रोटोकॉल विषम रूप से व्यक्त Hsp70 के चैपरोन फ़ंक्शन की खोज में E. coli dnaK756कोशिकाओं की उपयोगिता को प्रदर्शित करता है। इस परख को सेलूलो में एचएसपी 70 फ़ंक्शन को लक्षित करने वाले अवरोधकों को स्क्रीन करने क?…
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को इंटरनेशनल सेंटर फॉर जेनेटिक इंजीनियरिंग एंड बायोटेक्नोलॉजी (ICGEB) अनुदान संख्या, HDI/CRP/012, वेंडा विश्वविद्यालय के अनुसंधान निदेशालय, अनुदान I595, विज्ञान और नवाचार विभाग (DSI) और दक्षिण अफ्रीका के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) (अनुदान संख्या, 75464 और 92598) से प्राप्त अनुदान निधि के साथ समर्थित किया गया था।
2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |