Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

Resumo

Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Resumo

A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma proteína conservada que facilita o enovelamento de outras proteínas dentro da célula, tornando-a uma chaperona molecular. Enquanto Hsp70 não é essencial para células de E. coli crescendo em condições normais, esta chaperona torna-se indispensável para o crescimento em temperaturas elevadas. Uma vez que a Hsp70 é altamente conservada, uma maneira de estudar a função de chaperona de genes de Hsp70 de várias espécies é expressá-los heterologamente em cepas de E. coli que são deficientes em Hsp70 ou expressam uma Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. As células de E. coli dnaK756 são incapazes de suportar o DNA do bacteriófago λ. Além disso, sua Hsp70 nativa (DnaK) exibe atividade ATPase elevada, enquanto demonstra afinidade reduzida por GrpE (fator de troca de nucleotídeos Hsp70). Como resultado, as células de E. coli dnaK756 crescem adequadamente em temperaturas que variam de 30 °C a 37 °C, mas morrem em temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razão, essas células servem de modelo para o estudo da atividade de chaperona da Hsp70. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação dessas células na realização de um ensaio de complementação, possibilitando o estudo da função da chaperona in cellulo da Hsp70.

Introdução

As proteínas de choque térmico desempenham um papel importante como chaperonas moleculares, facilitando o enovelamento de proteínas, prevenindo a agregação proteica e revertendo o mau enovelamento de proteínas ^1,2. A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma das chaperonas moleculares mais proeminentes, desempenhando um papel central na homeostase proteica ^3,4. DnaK é o homólogo 5 de E. coli Hsp70^.

Vários ensaios biofísicos, bioquímicos e baseados em células foram desenvolvidos para explora....

Protocolo

1. Transformação

OBS: Utilize vidraria estéril para cultura, ponteiras de pipeta e meios recém-preparados e autoclavados. Preparar culturas das células de E. coli em ágar 2x triptona de levedura (YT) [1,6% triptona (p/v), 1% extrato de levedura (p/v), 0,5% NaCl (p/v), 1,5% ágar (p/v)]. Os reagentes gerais utilizados no protocolo e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Rotular tubos de microcentrífuga de 2,0 mL e alíquota de 50 μL de células competentes de E. coli dnaK756, mantendo as células no gelo.
2. Para os tubos de microcentrífuga de 2,0 mL com células co....

Resultados

A Figura 2 apresenta a imagem do ágar escaneado contendo células que foram manchadas e cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C e 43,5 °C, respectivamente. No lado direito da Figura 2, os componentes do western blot excisados representam a expressão de DnaK, KPf e KPf-V436F em células de E. coli dnaK756. Como esperado, todas as células de E. coli dnaK756 cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C conseguiram .......

Discussão

O protocolo demonstra a utilidade das células dnaK756 de E. colina exploração da função chaperona de Hsp70 heterologamente expressa. Este ensaio pode ser adotado para rastrear inibidores visando a função de Hsp70 em celulose. No entanto, uma limitação deste método é que Hsp70s incapazes de substituir DnaK em E. coli não são compatíveis com este ensaio. A falta de modificação pós-traducional²¹ de algumas Hsp70s não-nativas pode explicar sua falta de função dentro do siste.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituinte para corante de carregamento de amostra
Ácido acético	Labchem	101005125	Constituinte do descorante
Acrilamida	Sigma-Aldrich	8008300100	Componente do ágar
	SDS Merck	HG000BX1.500	Constituinte do ensaio de crescimento médio e líquido
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified biologia molecular agarose
Persulfato de amônio	Sigma-Aldrich	101875295	Constituinte para gel SDS-PAGE
Ampicilina	VWR International	0339—EU— 25G	Antibiótico seletivo
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Componente do
SDS Bromofenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituinte para corante de carregamento de amostra
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Para preparação de células competentes
Coomassie azul brilhante	VWR International	443293X	SDS-PAGE corante
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituinte do tampão PBS
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Reagente de detecção de Western blot
Brometo de etídio	Thermofischer Scientific	17898	Corante intercalante de DNA
Glicerol	Merck	SAAR2676520L	Constituinte para corante de carregamento de amostra
Glicina	VWR International	10119CU	Componente do SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	indutor
Kanamycin	Melford	K0126	Antibiótico seletivo
Cloreto de magnésio	Merck	SAAR4123000EM	Constituinte do ensaio de crescimento médio e líquido
Metanol	Labchem	113140129	Constituinte do descorador
Fosfato de potássio monobásico	Merck	1,04,87,30,250	Constituinte do tampão PBS
Peptona	Merck	HG000BX4.250	Constituinte do ensaio de crescimento médio e líquido
Cloreto de potássio	Merck	SAAR5042020EM	Constituinte do tampão PBS
Membrana PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Membrana Western blot
Cloreto de sódio	Merck	SAAR5822320EM	Constituinte do ensaio de crescimento médio e líquido
Dodecil sulfato de sódio	VWR International	108073	Para resolver as proteínas expressas
Spectramax iD3	Separações	373705019	Leitor de placas automatizado
TEMED	VWR International	ACRO420580500	Componente do gel SDS
Tetraciclina	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Antibiótico seletivo
Tris	VWR International	19A094101	Componente do gel SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituinte para tampão de lavagem ocidental
Câmara de transferência ocidental	Thermofisher Scientific	PB0112	Transferência de proteína para a membrana de nitrocelulose
Extrato de levedura	Merck	HG000BX6.500	Constituinte do ensaio de crescimento médio e líquido
&alfa;-DnaK anticorpo	Inqaba	BK CAC09317	Anticorpo primário
&alfa;-coelho	Anticorpo Thermofischer scientific	31460	Anticorpo secundário