열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석
Summary
이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.
Abstract
열충격 단백질 70(Hsp70)은 세포 내에서 다른 단백질의 접힘을 촉진하여 분자 샤페론을 만드는 보존된 단백질입니다. Hsp70은 정상적인 조건에서 자라는 대장균 세포에 필수는 아니지만, 이 샤페론은 고온에서 자라는 데 없어서는 안 될 필수 요소입니다. Hsp70은 보존성이 높기 때문에 다양한 종의 Hsp70 유전자의 샤페론 기능을 연구하는 한 가지 방법은 Hsp70이 결핍되어 있거나 기능적으로 손상된 네이티브 Hsp70을 발현하는 대장균 균주에서 이질적으로 발현하는 것입니다. E. coli dnaK756 세포는 λ 박테리오파지 DNA를 지원할 수 없습니다. 또한, 그들의 네이티브 Hsp70(DnaK)은 GrpE(Hsp70 뉴클레오티드 교환 인자)에 대한 친화력이 감소하는 동안 상승된 ATPase 활성을 나타냅니다. 그 결과, 대장균 dnaK756 세포는 30°C에서 37°C 사이의 온도에서 적절하게 성장하지만 고온(>40°C)에서는 사멸합니다. 이러한 이유로, 이 세포들은 Hsp70의 샤페론 활성을 연구하기 위한 모델 역할을 합니다. 여기에서는 Hsp70의 셀룰로 샤페론 내 기능을 연구할 수 있는 보완 분석을 수행하기 위해 이러한 세포를 적용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
열충격 단백질은 단백질 접힘을 촉진하고, 단백질 응집을 방지하며, 단백질 잘못 접힘을 역전시킴으로써 분자 샤페론으로서 중요한 역할을 합니다 1,2. 열충격 단백질 70(Hsp70)은 단백질 항상성 3,4에서 중심적인 역할을 하는 가장 두드러진 분자 샤페론 중 하나입니다. DnaK는 대장균 Hsp70 상동체5입니다.
Hsp70의 샤페론 활성을 탐구하고 이 샤페론 6,7,8을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하기 위해 다양한 생물물리학적, 생화학적, 세포 기반 분석법이 개발되었습니다. Hsp70은 고도로 보존된 단백질입니다. 이러한 이유로, Plasmodium falciparum(말라리아의 주성분)과 같은 진핵 생물의 여러 Hsp70이 대장균 6,9에서 DnaK 기능을 대체하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 방식으로 대장균에서 Hsp70의 이종 발현을 포함하는 대장균 기반 보완 분석법이 개발되어 세포 보호 기능을 탐색했습니다. 일반적으로 이 분석에는 DnaK가 결핍되어 있거나 기능적으로 손상된 네이티브 DnaK를 발현하는 대장균 세포의 활용이 포함됩니다. DnaK는 정상적인 조건에서 대장균 성장에 필수적인 것은 아니지만, 세포가 고온이나 다른 형태의 스트레스와 같은 스트레스 조건에서 성장할 때 필수적입니다10,11.
보완 분석을 사용하여 Hsp70 기능을 연구하기 위해 개발된 대장균 균주에는 대장균 dnaK103(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) 및 대장균 dnaK756이 있습니다. 대장균 dnaK103 세포는 기능하지 않는 잘린 DnaK를 생성하며, 따라서 세포는 30°C에서 적절하게 성장하는 반면, 균주는 추위와 열 스트레스에 민감합니다12,13. 유사하게, 대장균 dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) 균주는 40°C 이상에서 성장하지 않는다14,15. 대장균 dnaK756 균주는 32, 455 및 468 위치에서 3개의 글리신-아스파르테이트 치환을 특징으로 하는 돌연변이 네이티브 DnaK(DnaK756)를 발현하여 손상된 단백질 증식 결과를 유발합니다. 결과적으로, 이 균주는 박테리오파지 λ DNA14에 내성이 있다. 또한 E. coli dnaK756은 ATPase 활성이 상승하는 반면 뉴클레오티드 교환 인자인 GrpE에 대한 친화력은 감소합니다16. 대장균 DnaK 돌연변이 균주는 보완 접근법을 통해 Hsp70의 샤페론 활성을 조사하기 위한 이상적인 모델 역할을 합니다. DnaK는 스트레스가 많은 조건에서만 필수적이기 때문에 보완 분석은 일반적으로 고온에서 수행됩니다(그림 1). 이 연구에 대장균을 사용하는 것의 몇 가지 이점은 잘 특성화된 게놈, 빠른 성장, 낮은 배양 및 유지 관리 비용17을 포함합니다.
이 기사에서는 Hsp70의 기능을 연구하기 위해 E. coli dnaK756 세포를 사용하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 분석에 사용된 Hsp70은 야생형 DnaK와 키메라 유도체인 KPf(Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18의 C-말단 기질 결합 도메인에 융합된 DnaK의 ATPase 도메인으로 구성됨)입니다. KPf-V436F는 돌연변이가 근본적으로 기질에 결합하는 것을 차단하여 샤페론 활성을 폐지하기 때문에 이질적으로 음성 대조군으로 발현되었다9.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 이질적으로 발현된 Hsp70의 샤페론 기능을 탐색하는 데 있어 E. coli dnaK756세포의 유용성을 보여줍니다. 이 분석법은 셀룰로에서 Hsp70 기능을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하는 데 채택될 수 있습니다. 그러나 이 방법의 한 가지 한계는 대장균 에서 DnaK를 대체할 수 없는 Hsp70이 이 분석법과 호환되지 않는다는 것입니다. 일부 non-native Hsp70의 번역후 변형(post-transl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국제 유전 공학 및 생명 공학 센터 (ICGEB) 보조금 번호, HDI / CRP / 012, 벤다 대학의 연구 이사회, 보조금 I595, 과학 혁신부 (DSI) 및 남아프리카 공화국 국립 연구 재단 (NRF) (보조금 번호, 75464 및 92598)에서 얻은 보조금 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
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