Анализ комплементации на основе Escherichia coli для изучения шаперонной функции белка теплового шока 70
Summary
Этот протокол демонстрирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70). Клетки E. coli dnaK756 служат моделью для анализа, поскольку они содержат нативный, функционально ослабленный Hsp70, что делает их восприимчивыми к тепловому стрессу. Гетерологичное введение функционального Hsp70 спасает дефицит роста клеток.
Abstract
Белок теплового шока 70 (Hsp70) является консервативным белком, который способствует сворачиванию других белков в клетке, что делает его молекулярным шапероном. В то время как Hsp70 не является необходимым для клеток E. coli , растущих в нормальных условиях, этот шаперон становится незаменимым для роста при повышенных температурах. Поскольку Hsp70 обладает высокой консервативностью, одним из способов изучения шаперонной функции генов Hsp70 различных видов является их гетерологическая экспрессия в штаммах E. coli , которые либо испытывают дефицит Hsp70, либо экспрессируют нативный Hsp70, который функционально скомпрометирован. Клетки E. coli dnaK756 не способны поддерживать λ ДНК бактериофага. Кроме того, их нативный Hsp70 (DnaK) проявляет повышенную активность АТФазы, демонстрируя при этом пониженное сродство к GrpE (фактор нуклеотидного обмена Hsp70). В результате клетки E. coli dnaK756 адекватно растут при температуре от 30 °C до 37 °C, но погибают при повышенных температурах (>40 °C). По этой причине эти клетки служат моделью для изучения шаперонной активности Hsp70. Здесь мы опишем подробный протокол применения этих клеток для проведения анализа комплементации, позволяющего изучить функцию шаперона в целлюлоне Hsp70.
Introduction
Белки теплового шока играют важную роль в качестве молекулярных шаперонов, облегчая сворачивание белков, предотвращая агрегацию белков и обращая вспять неправильное сворачивание белков 1,2. Белок теплового шока 70 (Hsp70) является одним из наиболее известных молекулярных шаперонов, играющих центральную роль в белковом гомеостазе 3,4. DnaK является гомологом E. coli Hsp705.
Различные биофизические, биохимические и клеточные анализы были разработаны для изучения активности шаперона Hsp70 и скрининга ингибиторов, нацеленных на этот шаперон 6,7,8. Hsp70 является высококонсервативным белком. По этой причине сообщалось, что несколько Hsp70 эукариотических организмов, таких как Plasmodium falciparum (основной возбудитель малярии), замещают функцию DnaK у E. coli 6,9. Таким образом, был разработан анализ комплементации на основе E. coli, включающий гетерологичную экспрессию Hsp70 у E. coli для изучения их цитопротекторной функции. Как правило, этот анализ включает в себя использование клеток E. coli, которые либо испытывают дефицит ДНКК, либо экспрессируют нативный ДНКК, который функционально скомпрометирован. В то время как ДНКК не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, она становится необходимой, когда клетки выращиваются в стрессовых условиях, таких как повышенные температуры или другиеформы стресса.
Штаммы E. coli, которые были разработаны для изучения функции Hsp70 с помощью анализа комплементации, включают E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) и E. coli dnaK756. Клетки E. coli dnaK103 продуцируют усеченный DnaK, который не функционирует, и поэтому клетки адекватно растут при 30 °C, в то время как штамм чувствителен к холоду и тепловому стрессу12,13. Аналогично, штамм E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) не поднимается выше 40 °C14,15. Штамм E. coli dnaK756 экспрессирует мутантный нативный DnaK (DnaK756), характеризующийся тремя заменами глицина на аспартат в положениях 32, 455 и 468, что приводит к нарушенным протеостатическим результатам. Следовательно, этот штамм устойчив к бактериофагу λ ДНК14. Кроме того, E. coli dnaK756 проявляет повышенную активность АТФазы, в то время как ее сродство к фактору нуклеотидного обмена, GrpE, снижено16. Кишечная палочка Мутантные штаммы DnaK служат идеальными моделями для исследования активности шаперона Hsp70 с помощью комплементационного подхода. Поскольку ДНКК необходим только в стрессовых условиях, анализ комплементации обычно проводится при повышенных температурах (рис. 1). Некоторые преимущества использования E. coli для этого исследования включают ее хорошо охарактеризованный геном, быстрый рост и низкую стоимость культивирования и содержания17.
В этой статье мы подробно опишем протокол, предполагающий использование клеток E. coli dnaK756 для изучения функции Hsp70. Hsp70, которые мы использовали в анализе, представляют собой DnaK дикого типа и его химерное производное KPf (состоящее из АТФазного домена DnaK, слитого с С-концевым субстрат-связывающим доменом Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F был гетерологически экспрессирован как отрицательный контроль, поскольку мутация, по сути, блокирует его от связывания субстратов, тем самым отменяя его шаперонную активность9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол демонстрирует полезность клеток E. coli dnaK756в исследовании шаперонной функции гетерологически экспрессируемого Hsp70. Этот анализ может быть использован для скрининга ингибиторов, нацеленных на функцию Hsp70 в целлюло. Однако одним из ограничений этого метода является то, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантовым финансированием, полученным от Международного центра генной инженерии и биотехнологии (ICGEB) номер гранта, HDI/CRP/012, Исследовательского директората Университета Венды, грант I595, Департамента науки и инноваций (DSI) и Национального исследовательского фонда (NRF) Южной Африки (номера грантов, 75464 и 92598), присужденных AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
