Ensayo de complementación basado en Escherichia coli para estudiar la función chaperona de la proteína de choque térmico 70
Summary
Este protocolo demuestra la actividad chaperona de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células de E. coli dnaK756 sirven como modelo para el ensayo, ya que albergan una Hsp70 nativa y funcionalmente deteriorada, lo que las hace susceptibles al estrés térmico. La introducción heteróloga de Hsp70 funcional rescata la deficiencia de crecimiento de las células.
Abstract
La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una proteína conservada que facilita el plegamiento de otras proteínas dentro de la célula, lo que la convierte en una chaperona molecular. Si bien Hsp70 no es esencial para las células de E. coli que crecen en condiciones normales, esta chaperona se vuelve indispensable para el crecimiento a temperaturas elevadas. Dado que Hsp70 está altamente conservado, una forma de estudiar la función chaperona de los genes Hsp70 de varias especies es expresarlos heterólogamente en cepas de E. coli que son deficientes en Hsp70 o expresan una Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. Las células de E. coli dnaK756 son incapaces de soportar el ADN del bacteriófago λ. Además, su Hsp70 nativo (DnaK) exhibe una elevada actividad de ATPasa al tiempo que demuestra una afinidad reducida por GrpE (factor de intercambio de nucleótidos Hsp70). Como resultado, las células de E. coli dnaK756 crecen adecuadamente a temperaturas que oscilan entre 30 °C y 37 °C, pero mueren a temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razón, estas células sirven como modelo para estudiar la actividad chaperona de Hsp70. Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de estas células para realizar un ensayo de complementación, lo que permite el estudio de la función chaperona in cellulo de Hsp70.
Introduction
Las proteínas de choque térmico desempeñan un papel importante como chaperonas moleculares al facilitar el plegamiento de proteínas, prevenir la agregación de proteínas y revertir el mal plegamiento de proteínas 1,2. La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una de las chaperonas moleculares más prominentes, desempeñando un papel central en la homeostasis de las proteínas 3,4. DnaK es el homólogo de E. coli Hsp705.
Se han desarrollado varios ensayos biofísicos, bioquímicos y celulares para explorar la actividad de la chaperona de Hsp70 y para detectar inhibidores dirigidos a esta chaperona 6,7,8. Hsp70 es una proteína altamente conservada. Por esta razón, se ha reportado que varias Hsp70 de organismos eucariotas, como Plasmodium falciparum (el principal agente de la malaria), sustituyen la función de DnaK en E. coli 6,9. De esta manera, se ha desarrollado un ensayo de complementación basado en E. coli que involucra la expresión heteróloga de Hsp70s en E. coli para explorar su función citoprotectora. Por lo general, este ensayo implica la utilización de células de E. coli que son deficientes para DnaK o que expresan un DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Si bien el DnaK no es esencial para el crecimiento de E. coli en condiciones normales, se vuelve esencial cuando las células se cultivan en condiciones estresantes, como temperaturas elevadas u otras formas de estrés10,11.
Las cepas de E. coli que se han desarrollado para estudiar la función de Hsp70 mediante un ensayo de complementación incluyen E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) y E. coli dnaK756. Las células de E. coli dnaK103 producen un DnaK truncado que no es funcional y, como tal, las células crecen adecuadamente a 30 °C, mientras que la cepa es sensible al estrés por frío y calor12,13. Del mismo modo, la cepa E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) no crece por encima de 40 °C14,15. La cepa de E. coli dnaK756 expresa un DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por tres sustituciones de glicina a aspartato en las posiciones 32, 455 y 468, lo que da lugar a resultados proteostáticos comprometidos. En consecuencia, esta cepa es resistente al bacteriófago λ ADN14. Además, E. coli dnaK756 exhibe una elevada actividad de ATPasa, mientras que su afinidad por el factor de intercambio de nucleótidos, GrpE, se reduce16. E. coli Las cepas mutantes DnaK sirven como modelos ideales para investigar la actividad chaperona de Hsp70 a través de un enfoque de complementación. Dado que el DnaK solo es esencial en condiciones de estrés, el ensayo de complementación se realiza normalmente a temperaturas elevadas (Figura 1). Algunas ventajas del uso de E. coli para este estudio incluyen su genoma bien caracterizado, su rápido crecimiento y el bajo costo de cultivo y mantenimiento17.
En este artículo, describimos en detalle un protocolo que involucra el uso de células de E. coli dnaK756 para estudiar la función de Hsp70. Las Hsp70 que empleamos en el ensayo son DnaK de tipo salvaje y su derivado quimérico, KPf (formado por el dominio ATPasa de DnaK fusionado con el dominio de unión al sustrato C-terminal de Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F se expresó heterólogamente como un control negativo, ya que la mutación esencialmente lo bloquea de unirse a los sustratos, anulando así su actividad chaperona9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo demuestra la utilidad de las células dnaK756 de E. colien la exploración de la función chaperona de la Hsp70 expresada heterólogamente. Este ensayo podría adoptarse para detectar inhibidores dirigidos a la función de Hsp70 en el celullo. Sin embargo, una limitación de este método es que las Hsp70 incapaces de sustituir al DnaK en E. coli no son compatibles con este ensayo. La falta de modificación postraduccional21 de algunas Hsp70 no nativas puede …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue financiado con fondos de subvención obtenidos del Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (ICGEB) número de subvención, HDI/CRP/012, Dirección de Investigación de la Universidad de Venda, subvención I595, Departamento de Ciencia e Innovación (DSI) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Sudáfrica (números de subvención, 75464 y 92598) otorgados a AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
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