Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Resumo

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Resumo

Os vetores virais adenoassociados (AAVs) são uma ferramenta notável para a investigação do sistema nervoso central (SNC). Capsídeos inovadores, como o AAV. PHP.eB, demonstram extensa transdução do SNC por injeção intravenosa em camundongos. Para obter transdução comparável, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x^{10 11} cópias do genoma/camundongo) é necessário em comparação com a injeção direta no parênquima do SNC. Em nosso grupo, a produção de AAV, incluindo AAV. O PHP.eB baseia-se em células HEK293T aderentes e no método de tripla transfecção. Alcançar altos rendimentos de AAV com células aderentes envolve um processo trabalhoso e intensivo em material. Essa restrição motivou o desenvolvimento de um protocolo para cultura de células em suspensão em tubos cônicos. Os AAVs gerados em células aderentes foram comparados com o método de produção em suspensão. Foram comparadas culturas em suspensão utilizando os reagentes de transfecção Polietilenimina ou TransIt. Os vetores AAV foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de iodixanol seguido de troca e concentração de tampão com filtro centrífugo. Com o método aderente, obteve-se uma média de 2,6 x 10¹² cópias do genoma (CG) no total, enquanto o método de suspensão e Polietilenimina produziram 7,7 x^{10 12} GC no total, e TransIt produziu 2,4 x 10¹³ GC no total. Não há diferença na eficiência de transdução in vivo entre vetores produzidos com aderência em relação ao sistema de células de suspensão. Em resumo, um protocolo de produção AAV baseado em células HEK293 de suspensão é introduzido, resultando em uma quantidade reduzida de tempo e mão de obra necessária para a produção de vetores, enquanto alcança rendimentos 3 a 9 vezes maiores usando componentes disponíveis de fornecedores comerciais para fins de pesquisa.

Introdução

O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965 e, desde então, tem sido usado em uma infinidade de^{aplicações1}. Os AAVs têm sido aplicados em pesquisas em neurociência para estudar genes e funções neuronais, mapear neurocircuitos ou produzir modelos animais para doenças². Tradicionalmente, isso é feito injetando-se diretamente no local de interesse, pois a maioria dos sorotipos naturais não atravessa a barreira hematoencefálica ou necessita de uma dose alta para fazê-lo ^1,2,3.

Com a descoberta da ....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Royal Netherlands Academy of Sciences (KNAW) e estavam de acordo com a Lei Holandesa de Experimentação Animal sob o projeto número AVD8010020199126. Na Figura 1, uma visão geral esquemática do protocolo completo é fornecida. Da semeadura das células à purificação do AAV, o protocolo leva 6 dias para ser concluído.

1. Preparação dos reagentes

1. Purificação de plasmídeos
   1. Realizar extração de plasmídios conforme descrito pelo fabricante com alguns ajustes para garantir a es....

Resultados

A maioria dos laboratórios acadêmicos utiliza células HEK293T aderentes para a produção de AAV ^8,9. Embora isso funcione relativamente bem quando pequenas quantidades de AAV são necessárias para injeção direta, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x 10¹¹ GC/mouse) é necessário para obter transdução semelhante com capsídeos sistêmicos, como AAV. PHP.eB.

Nesse protocolo, foi estabelecida a produção de AAV utilizando célula.......

Discussão

A administração sistêmica de AAV é uma poderosa ferramenta para a transferência gênica para o SNC; no entanto, a produção de AAV é um processo caro e trabalhoso. Com o uso de células de suspensão, a mão de obra e os plásticos são reduzidos em comparação com a cultura aderente de HEK293T em placas de 15^cm2 . Além disso, os tubos cônicos implementados aqui são fáceis de manusear e maximizam o uso do espaço do laboratório. O protocolo foi montado por dois pesquisadores e, posteriormente, aplicado por outros no la.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de Polipropileno Redondo Quick-Seal de 39 mL, 25 x 89 mm - 50Pk	de 342414		Coulter Beckman
Tubos cônicos de 600 mL, para rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Placa Adaptadora se encaixa em 16 biorreatores de 600 ml	Infors HT / TPP	587633
Tampas à prova de aerossóis, para baldes redondos de 750 mL	eppendorf	5820747005
Centrífuga 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, baldes redondos e adaptador 15 mL / 50 mL tubos cônicos	eppendorf	5948000315
Água Destilada	Gibco
DNase I recombinante, sem RNase	Roche	4716728001
DNase I recombinante, sem RNase Roche		4716728001
DPBS, cálcio, magnésio	Gibco	14040091
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190144
Fisherbrand Unidades de filtro PES descartáveis 0,2	Fisher
Unidades de Filtro PES Descartáveis Fisherbrand 0,45	de FB12566505		Fisher
para tubos de cultura de 50 ml também se encaixa no tubo de falcão	Infors HT / TPP	31362
Suporte para tubo de cultura de células de 600 ml	Infors HT / TPP	66129
Incubadora Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Meio de Produção	Gibco
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Cloridrato de Polietilenomina Linear de Grau de Transfecção (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Solução de Fenol vermelho	Sigma-Aldrich	72420100
Poli (etilenoglicol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	Gibco	5250061
Biorreatores TubeSpin-50ml	TTP	87050
Biorreatores TubeSpin-600ml	TTP	87600
Células de Produção Viral	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363

Adaptador 15230147FB12566504 Suporte A3583401