Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Resumo

Agentes fibrinogenolíticos que podem dissolver o fibrinogênio diretamente têm sido amplamente utilizados no tratamento anticoagulante. Geralmente, a identificação de novos agentes fibrinogenolíticos requer a separação de cada componente primeiro e, em seguida, a verificação de suas atividades fibrinogenolíticas. Atualmente, a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a cromatografia são usadas principalmente na etapa de separação. Enquanto isso, o ensaio em placa de fibrinogênio e produtos de reação baseados em PAGE são geralmente adotados para exibir suas atividades fibrinogenolíticas. No entanto, devido à separação espaço-temporal desses dois estágios, é impossível separar e exibir os agentes fibrinogenolíticos ativos com o mesmo gel. Para simplificar os processos de separação e exibição da identificação do agente fibrinogenolítico, construímos um novo método fibrinogênio-PAGE para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de vermes do amendoim (Sipunculus nudus) neste estudo. Este método inclui preparação de fibrinogênio-PAGE, eletroforese, renaturação, incubação, coloração e descoloração. A atividade fibrinogenolítica e o peso molecular da proteína podem ser detectados simultaneamente. De acordo com este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo de sem-fim de amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.

Introdução

Nos últimos anos, devido ao aumento contínuo das doenças trombóticas, as doenças trombóticas tornaram-se um novo grande problema de saúde global¹. Atualmente, os antitrombóticos são classificados em três grupos: antiagregantes plaquetários, anticoagulantes e trombolíticos. Entre eles, drogas trombolíticas, como uroquinase (Reino Unido), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), etc., são as únicas drogas clinicamente usadas que podem hidrolisar o trombo². Enquanto isso, drogas trombolíticas mais seguras e eficazes estão sendo desenvolvidas pela identificação de novos agentes trombolítico....

Protocolo

1. Preparação do homogeneizado do sem-fim do amendoim

1. Adicione 50 g de vermes de amendoim e 150 mL de solução salina no homogeneizador.
2. Homogeneizar a 24000 rpm por 60 s.
   NOTA: Repita 3 vezes.
3. Centrifugar o homogenato a 9710 x g durante 30 min a 4 °C.
4. Colete o sobrenadante como homogeneizado do verme do amendoim para um estudo mais aprofundado.

2. Preparação do gel Fibrinogen-PAGE

1. Pesar 0,01 g de fibrinogênio em um copo de vidro de 50 mL.
2. Adicione 1,9 mL de DDH₂O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,....

Resultados

Após a eletroforese, todas as bandas do marcador foram claramente exibidas. As pistas de carregamento 1x SDS-PAGE mostraram apenas bandas de 10 kDa (azul de bromofenol). As amostras de sFE e verme do amendoim não apresentaram bandas observáveis (Figura 1). Embora as bandas das amostras não sejam visíveis, o desempenho do marcador e do azul de bromofenol indicou que a eletroforese foi bem-sucedida, e as amostras foram separadas de acordo com seu peso molecular.

Emb.......

Discussão

sFE é uma nova enzima fibrino(geno)lítica isolada de vermes de amendoim por nossa equipe anteriormente 3,6,8,13. No entanto, os processos de identificação da sFE foram demorados e trabalhosos, envolvendo as etapas de detecção da atividade fibrinogenolítica, separação dos componentes proteicos e confirmação da atividade. Como um método simples, o ensaio em placa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1  M Tris-HCl (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)	Solarbio	T1010
30% Acrilamida/Bis-acrilamida	Biosharp	BL513B
Persulfato de amônio	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Copo	PYREX	2-9425-02
Tubo de Centrífuga (1,5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Incubadora de Temperatura Constante	JINGHONG	JHS-400
Coomas Solução de coloração azul brilhante	Beyotime	P0017F
Balança Analítica Eletrônica	DENVER	TP-213
Fibrinogen		Solarbio F8051
Pontas de pipeta de carregamento de gel, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogeneizador	AHS	ATS-1500
Oscilador de rotação horizontal	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Referência	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina	Sigma	T9281
Ponta de pipeta (1 mL)	Ponta de Pipeta Axygene	T-1000XT-C
(10 µ L)	Axygene	T-10XT-C
(200 µ L)	Axygene	T-200XT-C
Pipetador (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipetador (10µ L)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipetador (200 µ L)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipetador (50 µ L)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Centrífuga Refrigerada	cence	H1650R
Dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200

Ponta de Pipeta