Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for generering og rensing av adenoassosierte virale vektorer ved bruk av en optimalisert heparinbasert affinitetskromatografimetode. Den presenterer en enkel, skalerbar og kostnadseffektiv tilnærming, og eliminerer behovet for ultrasentrifugering. De resulterende vektorene utviser høy renhet og biologisk aktivitet, noe som viser deres verdi i prekliniske studier.
Adenoassosiert virus (AAV) har blitt en stadig mer verdifull vektor for in vivo genlevering og gjennomgår for tiden kliniske studier på mennesker. Imidlertid bruker de ofte brukte metodene for å rense AAVer cesiumklorid eller iodixanoltetthetsgradient ultrasentrifugering. Til tross for fordelene er disse metodene tidkrevende, har begrenset skalerbarhet og resulterer ofte i vektorer med lav renhet. For å overvinne disse begrensningene, vender forskere oppmerksomheten mot kromatografiteknikker. Her presenterer vi en optimalisert heparinbasert affinitetskromatografiprotokoll som fungerer som et universelt fangsttrinn for rensing av AAV-er.
Denne metoden er avhengig av den iboende affiniteten til AAV serotype 2 (AAV2) for heparansulfatproteoglykaner. Spesifikt innebærer protokollen at plasmider koder for de ønskede AAV-kapsidproteinene med AAV2, noe som gir mosaikk-AAV-vektorer som kombinerer egenskapene til begge foreldreserotypene. Kort sagt, etter lysering av produsentceller, blir en blanding som inneholder AAV-partikler direkte renset etter en optimalisert enkelttrinns heparinaffinitetskromatografiprotokoll ved bruk av et standard FPLC-system (Fast Protein Liquid Chromatography). Rensede AAV-partikler blir deretter konsentrert og utsatt for omfattende karakterisering med hensyn til renhet og biologisk aktivitet. Denne protokollen tilbyr en forenklet og skalerbar tilnærming som kan utføres uten behov for ultrasentrifugering og gradienter, noe som gir rene og høye virale titere.
Adeno-associated virus (AAV) vektor er i ferd med å erobre sin vei som et av de mest lovende leveringssystemene i dagens genterapistudier. Opprinnelig identifisert i 19651, er AAV et lite, ikke-innkapslet virus, med et icosahedral proteinkapsid på ca. 25 nm i diameter, som har et enkeltstrenget DNA-genom. AAV-er tilhører Parvoviridae-familien og Dependoparvovirus-slekten på grunn av deres unike avhengighet av samtidig infeksjon med et hjelpervirus, som herpes simplex-virus eller, oftere, adenovirus, for å fullføre sin lytiske syklus 2,3.
Det 4,7 kilo tunge genomet til AAV-er består av to åpne leserammer (ORF) flankert av to inverterte terminale repetisjoner (ITR) som danner karakteristiske T-formede hårnålsender4. ITR er de eneste cis-virkende elementene som er kritiske for AAV-pakking, replikering og integrasjon, og er derfor de eneste AAV-sekvensene som beholdes i rekombinante AAV (rAAV) vektorer. I dette systemet leveres genene som er nødvendige for vektorproduksjon separat, i trans, slik at genet av interesse kan pakkes inn i viruskapsidet 5,6.
Hvert virusgen kodifiserer forskjellige proteiner gjennom alternativ spleising og startkodoner. Innenfor Rep ORF er fire ikke-strukturelle proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 og Rep78) kodet, og spiller avgjørende roller i replikasjon, stedsspesifikk integrasjon og innkapsling av viralt DNA 7,8. Cap ORF fungerer som en mal for uttrykket av tre strukturelle proteiner som skiller seg fra hverandre ved deres N-terminal, (VP1, VP2 og VP3), som samles for å danne et 60-mer viralt kapsid i forholdet 1: 1: 10 4,9. I tillegg koder et alternativt ORF nestet i Cap-genet med et ikke-konvensjonelt CUG-startkodon for et samlingsaktiverende protein (AAP). Dette nukleære proteinet har vist seg å interagere med de nylig syntetiserte kapsidproteinene VP1-3 og fremme kapsidmontering10,11.
Forskjeller i aminosyresekvensen til kapsidet forklarer de 11 naturlig forekommende AAV-serotypene og over 100 varianter isolert fra mennesker og ikke-humant primatvev 7,12,13. Variasjoner i konformasjonen av strukturelt variable regioner styrer de distinkte antigene egenskapene og reseptorbindende spesifisitetene til kapsider fra forskjellige stammer. Dette resulterer i distinkte vevstropismer og transduksjonseffektivitet på tvers av forskjellige pattedyrorganer14.
Tidlige produksjonsmetoder for rAAVs baserte seg på adenovirusinfeksjon for hjelperformål 15,16,17,18,19. Til tross for at det er effektivt og vanligvis enkelt å produsere i stor skala, oppstår flere problemer fra denne infeksjonen. Selv etter rensingen og et varmedenaturerende trinn for inaktivering kan adenovirale partikler fortsatt være til stede i AAV-preparater, noe som utgjør et uønsket sikkerhetsproblem20. Videre er tilstedeværelsen av denaturerte adenovirale proteiner uakseptabelt for klinisk bruk. Andre produksjonsstrategier utnytter rekombinante herpes simplex-virusstammer konstruert for å bringe Rep / Cap og transgen inn i målcellene21 eller av baculovirus-insektcellesystemet22. Selv om disse systemene gir fordeler når det gjelder skalerbarhet og GMP-kompatibilitet, står de fortsatt overfor lignende problemer.
Trippeltransfeksjonsmetoden for rAAV-produksjon har ofte blitt brukt for å enkelt overvinne disse problemene. Kort fortalt er rAAV-samlingen avhengig av transient transfeksjon av celler med tre plasmider som koder for: 1) transgenekspresjonskassetten pakket mellom ITR-ene fra villtype AAV2-genomet (pITR); 2) Rep / Cap-sekvensene som er nødvendige for replikasjon og virionmontering (pAAV-RC); og 3) de minimale adenovirale proteinene (E1A, E1B, E4 og E2A) sammen med adenovirusvirusassosierte RNA som kreves for hjelpereffekten (pHelper) 6,20,23. Mens plasmidtransfeksjonsmetoder gir enkelhet og fleksibilitet for rAAV-produksjon i prekliniske studier, har disse prosedyrene begrensninger når det gjelder skalerbarhet og reproduserbarhet når de brukes på storskala produksjon. Som en alternativ tilnærming kan rAAV-produksjon oppnås ved bruk av AAV-produsentcellelinjer (med både adherent og suspensjonsvekst), som stabilt uttrykker enten AAV Rep/Cap-gener eller Rep/Cap i kombinasjon med vektorkonstruksjoner. I disse systemene blir adenovirale hjelpergener introdusert gjennom plasmidtransfeksjon. Selv om denne strategien forbedrer skalerbarheten til cellekulturprosessen, er den teknisk kompleks og tidkrevende 21,24,25.
I begge tilfeller lyseres produsentcellene og utsettes for ett eller flere rensetrinn. For tiden inkluderer de viktigste metodene for rensing av rAAVs bruk av cesiumklorid (CsCl) eller iodixanol ultra-high speed density gradient sentrifugering fulgt, eller ikke, av kromatografiteknikker26. Det opprinnelige renseskjemaet for viral utfelling brukte ammoniumsulfat, etterfulgt av to eller tre runder med ultrasentrifugering gjennom en CsCl-gradient. De viktigste fordelene ved denne prosessen inkluderer muligheten til å rense alle serotyper og evnen til fysisk å skille fulle partikler fra tomme kapsider basert på deres forskjellige tettheter. Denne metoden er imidlertid forseggjort, tidkrevende og har begrenset skalerbarhet, noe som ofte resulterer i dårlig utbytte og lav prøvekvalitet 27,28,29,30. Videre er dialyse mot en fysiologisk buffer ofte nødvendig før in vivo studier på grunn av de toksiske effektene som CsCl kan utøve på pattedyr.
Iodixanol har også blitt brukt som et alternativt iso-osmotisk gradientmedium for å rense rAAV-vektorer, med fordeler over CsCl fra både sikkerhets- og vektorstyrkesynspunkter. Imidlertid, som CsCl, presenterer iodixanol-metoden noen ulemper knyttet til belastningskapasiteten til cellekulturlysat (og dermed skalerbarheten til rAAV-rensing), og det er fortsatt en tidkrevende og kostbar metode30,31.
For å overvinne disse begrensningene, vendte forskerne oppmerksomheten mot kromatografiteknikker. I denne forbindelse ble det utviklet flere rensemetoder som enten inkorporerer affinitets-, hydrofobe eller ionebytterkromatografimetoder. Disse metodene er avhengige av de biokjemiske egenskapene til en bestemt serotype, inkludert deres naturlige reseptorer, eller ladningsegenskapene til viruspartikkel32. For eksempel åpnet oppdagelsen av at AAV2, AAV3, AAV6 og AAV13 fortrinnsvis binder seg til heparansulfatproteoglykaner (HSPG), muligheten for å bruke det nært beslektede heparinet i affinitetskromatografirensing. Imidlertid kan bindingsstedene til HSPG variere mellom serotyper, mediere AAV-tilknytning og infeksjon av målceller på forskjellige måter 2,33,34,35,36. På den annen side binder AAV1, AAV5 og AAV6 seg til N-bundet sialinsyre (SA), mens AAV4 bruker O-bundet SA 2,14,34. Etter samme begrunnelse er det også utviklet en ett-trinns affinitetskromatografiprotokoll for rensing av rAAV5 basert på bruk av mucin, et pattedyrprotein som er høyt anriket i SA37. Som heparinbaserte teknikker er denne rensingen også avhengig av den spesifikke serotypen som genereres. Bortsett fra heparin og mucin, har andre ligander blitt undersøkt for affinitetskromatografi, slik som A20 monoklonalt antistoff og kamelid enkeltdomeneantistoffer (AVB Sepharose og POROS CaptureSelect) 22,23,38,39,40,41. Andre innovative strategier for å forbedre de tidligere eksisterende rensemetodene innebærer innføring av små modifikasjoner i rAAV-kapsidet for å presentere spesifikke bindingsepitoper. For eksempel kan heksa-histidinmerkede eller biotinylerte rAAVer renses ved hjelp av ligander som retter seg mot disse epitopene (henholdsvis nikkelnitrilotrieddiksyre og avidinharpikser)42,43,44.
I et forsøk på å utvide de ønskede egenskapene til rAAV, har etterforskerne krysskledd virionene ved å blande kapsidene deres. Dette oppnås ved å tilføre kapsidgenet fra to distinkte AAV-serotyper i ekvimolære eller forskjellige forhold under produksjonen, noe som gir opphav til en kapsidstruktur sammensatt av en blanding av kapsidunderenheter fra forskjellige serotyper 34,45,46,47,48,49,50 . Tidligere studier gir fysiske bevis på at samuttrykkende kapsidproteiner fra AAV2 med AAV1 (1:1-forhold) og AAV2 med AAV9 (1:1-forhold) resulterer i generering av mosaikk-rAAV1/2- og rAAV2/9-vektorer, henholdsvis 45,46,48. En stor fordel med genereringen av mosaikk-rAAV-er er kapasiteten til å integrere fordelaktige egenskaper fra forskjellige AAV-serotyper, noe som resulterer i synergistiske forbedringer i transgenuttrykk og tropisme, samtidig som andre egenskaper som er nyttige under rAAV-produksjon, opprettholdes. Interessant nok viser visse mosaikkvarianter til og med nye egenskaper som er forskjellige fra foreldrevirus 46,47,49. Ved å utnytte den heparinbindende evnen til AAV2, kan mosaikk-rAAV-vektorer potensielt genereres og renses ved å blande AAV2 med andre naturlige eller nye AAV-kapsider generert av rettet evolusjon og/eller rasjonell design. Ikke desto mindre har tidligere studier fremhevet viktigheten av kapsidunderenhetskompatibilitet når man forsøker å sette sammen mosaikkvektorer. For eksempel viste Rabinowitz og kolleger at selv om transkapsidasjonen av AAV1, AAV2 og AAV3 førte til en effektiv sammontering av mosaikkkapsider, hindret kryssdressingen av disse serotypene med AAV4 genereringen av stabile virioner 34,45,47. I tillegg viste AAV1, AAV2 og AAV3 lav kompatibilitet med AAV5, gitt de reduserte virale titere oppnådd ved blanding av disse kapsidene i forskjellige forhold. Interessant nok viste mosaikk rAAV2/5 reduserte heparinbindende egenskaper, samtidig som mucinbindingsevnen som foreldrenes AAV5 ble opprettholdt. Imidlertid bevarte rAAV3/5 i forholdet 3:1 den doble bindingen til heparin og mucin. Samlet sett kan genereringen av nye mosaikk-rAAV-er med forbedret transduksjon, spesifikk tropisme eller lav immunogenitet ha stor nytte av vår forståelse av kapsidmontering og reseptorinteraksjoner, med spesifikke kombinasjoner som fortsatt krever grundig undersøkelse og optimalisering.
I dette arbeidet beskriver vi en trinnvis protokoll for produksjon og rensing av rAAVer ved hjelp av en optimalisert heparinaffinitetskromatografimetode. rAAV produseres ved forbigående transfeksjon og renses ved hjelp av et raskt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Etter konsentrasjonen av utvalgte rensede fraksjoner karakteriseres de resulterende virale bestandene i form av titer, renhet, iboende fysiske egenskaper og biologisk aktivitet in vitro og in vivo. Som et bevis på konsept demonstrerer vi forbedringene og anvendeligheten av denne protokollen for generering av mosaikk rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer. Valget av hver serotype var basert på deres påfallende forskjellige tropismer, som potensielt også ga deres unike egenskaper til mosaikkversjonene. AAV serotype 1, med en generell moderat tropisme for sentralnervesystemet (CNS), har evnen til å transdusere nevroner og glia (i mindre grad) og gjennomgår aksonal transport i anterograd og retrograd retning in vivo 2,7,8. I tillegg ble AAV serotype 9 valgt for sin naturlige evne til å krysse blod-hjernebarrieren og målrette CNS hos både nyfødte og voksne mus51,52. Til slutt ble AAV serotype 2 valgt på grunn av evnen til å binde seg til heparin, noe som muliggjorde affinitetskromatografi33. De rensede rAAV1/2- og rAAV2/9-partiklene kombinerer egenskapene til begge foreldrenes AAV-serotyper og utgjør derfor egnede vektorer for transduksjon av CNS 45,46,48,49.
Det raskt voksende AAV-vektorverktøyet har blitt et av de mest lovende genleveringssystemene for et bredt spekter av celletyper gjennom ulike administrasjonsveier. I dette arbeidet hadde vi som mål å utvikle en forbedret protokoll for produksjon, rensing og karakterisering av mosaikk-rAAV-vektorer som kunne bevise sin verdi i prekliniske studier. For dette formålet er genereringen av rAAV1/2 og rAAV2/9 mosaikkvektorer beskrevet her, men prosedyren kan også brukes til å rense standard rAAV2-vektorer (data ikke vist).
Mosaic rAAVs ble produsert etter en optimalisert transfeksjonsmetode ved bruk av PEI som transfeksjonsreagens. En forbigående transfeksjonsmetode ble valgt på grunn av større fleksibilitet og hastighet, betydelige fordeler i prekliniske studier på tidlig stadium. Når et bestemt transgen og serotype er validert, kan produksjonssystemet finjusteres for å oppnå bedre skalerbarhet og kostnadseffektivitet ved å etablere en stabil transfeksjonert cellelinje som uttrykker en delmengde av de spesifikke Rep / Cap-gener , med ytterligere gener levert av en infeksjonsprosess24. Sammenlignet med kalsiumfosfattransfeksjon presenterer PEI flere fordeler. Det er et stabilt og kostnadseffektivt transfeksjonsreagens som fungerer effektivt innenfor et bredere pH-område. I tillegg eliminerer det kravet om å endre cellemediet etter transfeksjon, noe som resulterer i en betydelig reduksjon i både kostnad og arbeidsbelastning69.
I et forsøk på å omgå noen av begrensningene som ble pålagt av CsCl eller jodixanolgradienter, ble de produserte rAAVene høstet og renset ved affinitetskromatografi. Denne strategien tilbyr en forenklet og skalerbar tilnærming som kan utføres uten behov for ultrasentrifugering og gradienter, noe som gir rene og høye virale titer. Faktisk kan kromatografiteknikker ved hjelp av et FPLC-system automatiseres og skaleres opp ved å pakke mer harpiksvolum i en kolonne med høyere sengehøyde. Protokollen beskrevet her kan enkelt tilpasses for å inkludere 5 ml HiTrap Heparin HP-kolonner (data ikke vist). I tillegg kan heparinkolonner gjenbrukes flere ganger, og dermed bidra til kostnadseffektiviteten til denne metoden.
De rensede rAAV-ene ble deretter karakterisert i form av titer, renhet, morfologiske egenskaper og biologisk aktivitet. Interessant, i Coomassie blå farging ble et bånd med ca. 17 kDa detektert i fraksjoner F8-F16 i tillegg til de tre typiske virale kapsidproteinene. Dette båndet er imidlertid ikke lenger til stede etter konsentrasjonstrinnet til rAAV. Videre kan noen svake bånd med molekylvekter lavere enn VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-merking, noe som tyder på at disse kan være fragmenter av VP1-, VP2- og VP3-kapsidproteinene70. En annen mulighet er at dette faktisk er andre samrensende proteiner som ferritin eller andre cellulære proteiner med polypeptider som deler lignende proteinfingeravtrykk med AAV-kapsidproteinene og kan være involvert i AAV-biologien, som tidligere antydet 26,71,72.
TEM og stunner analyse avslørte også tilstedeværelsen av tomme partikler på variable nivåer på tvers av forskjellige produksjoner. Tilsvarende rapporterte andre studier tidligere generering av variable og høye nivåer (>65%) av tomme kapsider for rAAVs fremstilt ved transfeksjon eller infeksjonsmetoder24,73. Mekanismen bak rAAV-generering starter med den raske dannelsen av tomme kapsider fra nylig syntetiserte VP-proteiner, etterfulgt av et langsomt hastighetsbegrensende trinn av genomemballasje i de preformerte kapsidene mediert av Rep-proteiner 74,75. Derfor genereres tomme kapsider i rAAV-produksjoner, selv om andelen tomme og fulle kapsider kan variere avhengig av størrelsen og sekvensen av transgenet av interesse og cellekulturforhold58,73. Tomme kapsider gir noen bekymringer siden de, ved å mangle genomet av interesse, ikke er i stand til å gi en terapeutisk effekt og kan også potensielt øke en medfødt eller adaptiv immunrespons. Noen rapporter har imidlertid også vist at tomme AAV-kapsider ved å justere forholdet kan tjene som svært effektive lokkeduer for AAV-spesifikke nøytraliserende antistoffer og dermed øke transduksjonseffektiviteten 60,76,77. Hvis tilstedeværelsen av tomme kapsider er kritisk skadelig og gitt den litt mindre anioniske karakteren til tomme partikler sammenlignet med fulle vektorer, kan en potensiell løsning innebære å gjennomføre et andre poleringsrensingstrinn ved hjelp av anionbyttekromatografiteknikker64.
Denne studien gir også overbevisende bevis på at de genererte mosaikk-rAAVene er i stand til effektivt å transdusere ikke bare in vitro nevronkulturer, men også CNS ved intrakraniell injeksjon av rAAV1/2. Samlet sett antyder disse resultatene at den beskrevne produksjons- og renseprotokollen gjør svært rene og biologisk aktive rAAV-er klare til bruk på 6 dager, og presenterer seg som en allsidig og kostnadseffektiv metode for generering av rAAVs i prekliniske studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for samarbeidet, innsikten og den tekniske assistansen fra Dr. Mónica Zuzarte, ved Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) og Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), angående TEM-analysen av rAAVs. Vi utvider vår takknemlighet til Dr. Dominique Fernandes, ved Senter for nevrovitenskap og cellebiologi ved Universitetet i Coimbra (CNC-UC) og Institutt for tverrfaglig forskning ved Universitetet i Coimbra (IIIUC), for hennes uvurderlige tekniske assistanse og innsikt om de primære nevronkultureksperimentene. pRV1-, pH21- og pFdelta6-plasmidene, som er essensielle for denne studien, ble sjenerøst levert av Dr. Christina McClure, ved School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, som vi er takknemlige for. Dette arbeidet ble finansiert av European Regional Development Fund (ERDF), gjennom Centro 2020 Regional Operational Program; gjennom COMPETE 2020 – Operativt program for konkurranseevne og internasjonalisering, og portugisiske nasjonale midler via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under prosjektene: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), Reset – IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Fighting Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); av American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) og Richard Chin og Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT under IMI2 JU Grant agreement No 945473 støttet av EU og EFPIA; GeneT- Teaming Project 101059981 støttet av EUs Horizon Europe-program. M.M.L. ble støttet av 2021.05776.BD; C.H. ble støttet av 2021.06939.BD; A.C.S. ble støttet av 2020.07721.BD; og D.D.L. ble støttet av 2020.09668.BD. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av BioRender.com.
10% povidone-iodine | Medline | MDS093943 | |
12-well plates | Thermo Scientific | 11889684 | |
24-well plates | VWR | 734-2325 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
96-well Stunner plate | Unchained Labs | 701-2025 | 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 | Takara | 6233 | For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water |
Acetic acid glacial | Fisher Chemical | A/0360/PB17 | |
ÄKTA pure 25 | Cytiva | 29018224 | FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 |
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse | Invitrogen | 31328 | |
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC5100 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC9100 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | E1014 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | 184-5096 | |
ChemiDoc Touch Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 1708370 | |
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody | Abcam | ab13970 | |
Coomassie Blue G250 | Fisher Chemical | C/P541/46 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Bioreagents | BP17225 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Cytiva | RPN5785 | |
FastDigest SmaI | Thermo Scientific | FD0663 | |
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin | FEI | Biotwin | Transmission electron microscope |
Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
Fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Formvar-carbon coated 200 mesh grid | TAAB Laboratories Equipment | F077/025 | |
Gas evacuation apparatus | RWD | R546W | |
Glycerol | Fisher BioReagents | 10021083 | |
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 | Hamilton | 7803-07 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Hamilton | 7653-01 | |
HEK293T | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL | Cytiva | 17040701 | Pre-packed heparin column |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva | 17040601 | Pre-packed heparin column |
Immobilon-P PVDF Membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Isoflurane | Braun | 469860 | |
Ketamine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Nimatek |
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 11906965 | |
Lunatic & Stunner Client software | Unchained Labs | N/A | Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Methanol | Fisher Chemical | M/4000/FP21 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) | American Research Products | 03-61057 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) | American Research Products | 03-61058 | |
Neuro2a | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 12738422 | |
NZYColour Protein Marker II | NZYtech | MB09002 | |
pAAV-CMV-scGFP | Addgene | 32396 | Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396 |
pAAV-CMV-ssGFP | Addgene | 105530 | Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530 |
pAAV2/9n | Addgene | 112865 | Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865 |
Paraformaldehyde | Acros Organics | 10342243 | |
PBS | Fisher BioReagents | BP2438 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) | Gibco | 24040032 | |
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 | Polysciences Europe | 24765 | |
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane | RWD | N/A | |
Sample Inlet Valve V9-IS | Cytiva | 29027746 | |
Sample pump P9-S | Cytiva | 29027745 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10428420 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Bioreagents | BP166 | |
Sterile PVDF syringe filter | Fisher Scientific | 15191499 | |
Stunner Platform | Unchained Labs | 700-2002 | Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Superloop 150 mL | Cytiva | 18-1023-85 | |
Superloop 50 mL | Cytiva | 18-1113-82 | |
SURE 2 supercompetent cells | Stratagene, Agilent Technologies | HPA200152 | |
Treated culture dishes | Corning | 734-1711 | |
Tris base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tris hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 | Invitrogen | W21404 | |
Xylazine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Sedaxylan |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective |
Zeiss Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective |
Zeiss LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective |
µ-Slide 8 well Ibidi | Ibidi | 80826 | 8-well chamber slide |