Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för generering och rening av adeno-associerade virala vektorer med hjälp av en optimerad heparinbaserad affinitetskromatografimetod. Det presenterar ett enkelt, skalbart och kostnadseffektivt tillvägagångssätt, vilket eliminerar behovet av ultracentrifugering. De resulterande vektorerna uppvisar hög renhet och biologisk aktivitet, vilket bevisar deras värde i prekliniska studier.
Adeno-associerat virus (AAV) har blivit en allt mer värdefull vektor för in vivo genleverans och genomgår för närvarande kliniska prövningar på människor. De vanligaste metoderna för att rena AAV:er använder sig dock av ultracentrifugering med cesiumklorid eller jodixanoldensitetsgradient. Trots sina fördelar är dessa metoder tidskrävande, har begränsad skalbarhet och resulterar ofta i vektorer med låg renhet. För att övervinna dessa begränsningar riktar forskare sin uppmärksamhet mot kromatografitekniker. Här presenterar vi ett optimerat heparinbaserat affinitetskromatografiprotokoll som fungerar som ett universellt infångningssteg för rening av AAV.
Denna metod bygger på den inneboende affiniteten hos AAV-serotyp 2 (AAV2) för heparansulfatproteoglykaner. Specifikt innebär protokollet samtransfektion av plasmider som kodar för de önskade AAV-kapsidproteinerna med de från AAV2, vilket ger mosaik-AAV-vektorer som kombinerar egenskaperna hos båda föräldrarserotyperna. Kortfattat, efter lys av producentceller, renas en blandning som innehåller AAV-partiklar direkt efter ett optimerat enstegs heparinaffinitetskromatografiprotokoll med hjälp av ett standardsystem för snabb proteinvätskekromatografi (FPLC). Renade AAV-partiklar koncentreras därefter och utsätts för omfattande karakterisering med avseende på renhet och biologisk aktivitet. Detta protokoll erbjuder ett förenklat och skalbart tillvägagångssätt som kan utföras utan behov av ultracentrifugering och gradienter, vilket ger rena och höga virala titrar.
Adeno-associerade virus (AAV) är på väg att erövra sin väg som ett av de mest lovande leveranssystemen i nuvarande genterapistudier. AAV, som ursprungligen identifierades 19651, är ett litet, icke-höljeförsett virus, med en ikosaedrisk proteinkapsid på cirka 25 nm i diameter, som innehåller ett enkelsträngat DNA-genom. AAVs tillhör familjen Parvoviridae och släktet Dependoparvovirus på grund av deras unika beroende av samtidig infektion med ett hjälparvirus, såsom herpes simplexvirus eller, mer ofta, adenovirus, för att fullborda sin lytiska cykel 2,3.
Det 4,7 kilobasiska genomet hos AAV:er består av två öppna läsramar (ORF) flankerade av två inverterade terminalupprepningar (ITR) som bildar karakteristiska T-formade hårnålsändar4. ITR:er är de enda cis-verkande elementen som är kritiska för AAV-paketering, replikering och integration, och är därför de enda AAV-sekvenser som behålls i rekombinanta AAV-vektorer (rAAV). I detta system tillförs de gener som är nödvändiga för vektorproduktion separat, in trans, vilket gör att genen av intresse kan förpackas inuti virusets kapsid 5,6.
Varje viral gen kodifierar olika proteiner genom alternativ splitsning och startkodon. Inom Rep ORF kodas fyra icke-strukturella proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 och Rep78) och spelar avgörande roller i replikation, platsspecifik integration och inkapsling av viralt DNA 7,8. Cap ORF fungerar som en mall för uttrycket av tre strukturella proteiner som skiljer sig från varandra vid deras N-terminal, (VP1, VP2 och VP3), som samlas för att bilda en 60-mer viral kapsid i förhållandet 1:1:10 4,9. Dessutom kodar en alternativ ORF som är inbäddad i Cap-genen med ett icke-konventionellt CUG-startkodon för ett monteringsaktiverande protein (AAP). Detta kärnprotein har visat sig interagera med de nyligen syntetiserade kapsidproteinerna VP1-3 och främja kapsidsammansättning10,11.
Skillnader i aminosyrasekvensen i kapsiden står för de 11 naturligt förekommande AAV-serotyperna och över 100 varianter isolerade från människor och icke-mänskliga primatvävnader 7,12,13. Variationer i konformationen av strukturellt variabla regioner styr de distinkta antigena egenskaperna och receptorbindande specificiteterna hos kapsider från olika stammar. Detta resulterar i distinkta vävnadstrosmer och transduktionseffektivitet över olika däggdjursorgan14.
Tidiga produktionsmetoder för rAAVs förlitade sig på adenovirusinfektion för hjälpändamål 15,16,17,18,19. Trots att infektionen är effektiv och vanligtvis lätt att producera i stor skala uppstår flera problem med den. Även efter rening och ett värmedenatureringssteg för inaktivering kan adenovirala partiklar fortfarande finnas kvar i AAV-preparat, vilket utgör en oönskad säkerhetsrisk20. Dessutom är förekomsten av denaturerade adenovirala proteiner oacceptabel för klinisk användning. Andra produktionsstrategier drar nytta av rekombinanta herpes simplex-virusstammar som är konstruerade för att föra Rep/Cap och transgenen in i målcellerna21 eller i baculovirus-insektscellsystemet22. Även om dessa system erbjuder fördelar när det gäller skalbarhet och GMP-kompatibilitet, står de fortfarande inför liknande problem.
Den tredubbla transfektionsmetoden för rAAV-produktion har ofta antagits för att enkelt övervinna dessa problem. Kortfattat bygger rAAV-sammansättningen på den transienta transfektionen av celler med tre plasmider som kodar för: 1) den transgenuttryckskassett som är packad mellan ITR:erna från vildtypens AAV2-genomet (pITR); 2) de Rep/Cap-sekvenser som krävs för replikation och virionmontering (pAAV-RC); och 3) de minimala adenovirala proteinerna (E1A, E1B, E4 och E2A) tillsammans med de adenovirusassocierade RNA som krävs för hjälpareffekten (pHelper)6,20,23. Medan plasmidtransfektionsmetoder ger enkelhet och flexibilitet för rAAV-produktion i prekliniska studier, har dessa procedurer begränsningar när det gäller skalbarhet och reproducerbarhet när de tillämpas på storskalig produktion. Som ett alternativt tillvägagångssätt kan rAAV-produktion uppnås genom användning av AAV-producentcellinjer (av både vidhäftande och suspensionstillväxt), som stabilt uttrycker antingen AAV Rep/Cap-gener eller Rep/Cap i kombination med vektorkonstruktioner. I dessa system introduceras de adenovirala hjälpargenerna genom plasmidtransfektion. Även om denna strategi förbättrar skalbarheten i cellodlingsprocessen är den tekniskt komplex och tidskrävande 21,24,25.
I båda fallen lyseras sedan producentcellerna och utsätts för ett eller flera reningssteg. För närvarande inkluderar de huvudsakliga metoderna för rening av rAAVs användning av cesiumklorid (CsCl) eller jodixanol ultrahöghastighets densitetsgradientcentrifugering följd, eller inte, av kromatografitekniker26. Det ursprungliga reningsschemat för viral utfällning använde ammoniumsulfat, följt av två eller tre omgångar av ultracentrifugering genom en CsCl-gradient. De främsta fördelarna med denna process inkluderar möjligheten att rena alla serotyper och förmågan att fysiskt separera hela partiklar från tomma kapsider baserat på deras olika densiteter. Denna metod är dock genomarbetad, tidskrävande och har begränsad skalbarhet, vilket ofta resulterar i dålig avkastning och låg provkvalitet 27,28,29,30. Dessutom är dialys mot en fysiologisk buffert ofta nödvändig före in vivo-studier på grund av de toxiska effekter som CsCl kan utöva på däggdjur.
Jodixanol har också använts som ett alternativt iso-osmotiskt gradientmedium för att rena rAAV-vektorer, med fördelar jämfört med CsCl ur både säkerhets- och vektorpotenssynpunkt. Liksom CsCl uppvisar dock jodixanolmetoden vissa nackdelar relaterade till laddningskapaciteten hos cellodlingslysat (och därmed skalbarheten av rAAV-rening) och det är fortfarande en tidskrävande och dyr metod30,31.
För att övervinna dessa begränsningar vände forskare sin uppmärksamhet mot kromatografitekniker. I detta avseende utvecklades flera reningsmetoder som antingen innehåller affinitets-, hydrofoba eller jonbyteskromatografimetoder. Dessa metoder är beroende av de biokemiska egenskaperna hos en viss serotyp, inklusive deras naturliga receptorer, eller laddningsegenskaperna hos viruspartikeln32. Till exempel öppnade upptäckten att AAV2, AAV3, AAV6 och AAV13 företrädesvis binder till heparansulfatproteoglykaner (HSPG), möjligheten att använda det närbesläktade heparinet vid rening av affinitetskromatografi. Bindningsställena till HSPG kan dock skilja sig åt mellan serotyper, vilket medierar AAV-bindning och infektion av målceller på olika sätt 2,33,34,35,36. Å andra sidan binder AAV1, AAV5 och AAV6 till N-kopplad sialinsyra (SA), medan AAV4 använder O-kopplad SA 2,14,34. I enlighet med samma logik har ett enstegs affinitetskromatografiprotokoll för rening av rAAV5 också utvecklats baserat på användning av mucin, ett däggdjursprotein som är starkt anrikat i SA37. Liksom heparinbaserade tekniker är denna rening också beroende av den specifika serotyp som genereras. Förutom heparin och mucin har andra ligander utforskats för affinitetskromatografi, såsom den monoklonala A20-antikroppen och camelid single-domain antikroppar (AVB Sepharose och POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Andra innovativa strategier för att förbättra de tidigare existerande reningsmetoderna involverar införandet av små modifieringar i rAAV-kapsiden för att presentera specifika bindande epitoper. Till exempel kan hexa-histidin-märkta eller biotinylerade rAAVs renas med hjälp av ligander som riktar sig mot dessa epitoper (nickelnitrilotriättiksyra respektive avidinhartser)42,43,44.
I ett försök att bredda de önskade egenskaperna hos rAAVs har forskare crossdressat virionerna genom att blanda deras kapsider. Detta åstadkoms genom att kapsidgenen tillförs från två distinkta AAV-serotyper i ekvimolära eller olika förhållanden under produktionen, vilket ger upphov till en kapsidstruktur som består av en blandning av kapsidunderenheter från olika serotyper 34,45,46,47,48,49,50. Tidigare studier ger fysiska bevis för att samuttryckande kapsidproteiner från AAV2 med AAV1 (1:1-förhållande) och AAV2 med AAV9 (1:1-förhållande) resulterar i generering av mosaikvektorer rAAV1/2 och rAAV2/9, respektive 45,46,48. En stor fördel med genereringen av mosaik-rAAVs är förmågan att integrera fördelaktiga egenskaper från olika AAV-serotyper, vilket resulterar i synergistiska förbättringar i transgenuttryck och tropism, samtidigt som andra egenskaper som är användbara under rAAV-produktion bibehålls. Intressant nog uppvisar vissa mosaikvarianter till och med nya egenskaper som skiljer sig från båda föräldravirusen 46,47,49. Genom att dra nytta av den heparinbindande förmågan hos AAV2 kan mosaik-rAAV-vektorer potentiellt genereras och renas genom att blanda AAV2 med andra naturliga eller nya AAV-kapsider som genereras genom riktad evolution och/eller rationell design. Icke desto mindre har tidigare studier belyst vikten av kompatibilitet med kapsidsubenheter när man försöker sätta ihop mosaikvektorer. Till exempel visade Rabinowitz och kollegor att även om transkapsidationen av AAV1, AAV2 och AAV3 ledde till en effektiv sammontering av mosaikkapsider, hindrade korsdressingen av dessa serotyper med AAV4 genereringen av stabila virioner 34,45,47. Dessutom visade AAV1, AAV2 och AAV3 låg kompatibilitet med AAV5, med tanke på de minskade virala titrar som erhölls vid blandning av dessa kapsider i olika förhållanden. Intressant nog visade mosaik rAAV2/5 minskade heparinbindande egenskaper, samtidigt som den bibehöll mucinbindande förmågan som föräldrarnas AAV5. Emellertid bevarade rAAV3/5 i förhållandet 3:1 den dubbla bindningen till heparin och mucin. Sammantaget kan genereringen av nya mosaik-rAAVs med förbättrad transduktion, specifik tropism eller låg immunogenicitet dra stor nytta av vår förståelse av kapsidmontering och receptorinteraktioner, med specifika kombinationer som fortfarande kräver noggrann undersökning och optimering.
I detta arbete beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för produktion och rening av rAAVs med hjälp av en optimerad heparinaffinitetskromatografimetod. rAAVs produceras genom transient transfektion och renas med hjälp av ett system med snabb proteinvätskekromatografi (FPLC). Efter koncentrationen av utvalda renade fraktioner karakteriseras de resulterande virusstammarna i termer av titer, renhet, inneboende fysikaliska egenskaper och biologisk aktivitet in vitro och in vivo. Som ett bevis på konceptet demonstrerar vi förbättringarna och tillämpligheten av detta protokoll för generering av mosaik rAAV1/2 och rAAV2/9 vektorer. Valet av varje serotyp baserades på deras slående olika tropismer, vilket kan ge deras unika egenskaper även till mosaikversionerna. AAV-serotyp 1, med en övergripande måttlig tropism för det centrala nervsystemet (CNS), har förmågan att transducera neuroner och glia (i mindre utsträckning) och genomgår axonal transport i anterograd och retrograd riktning in vivo 2,7,8. Dessutom valdes AAV serotyp 9 för sin naturliga förmåga att passera blod-hjärnbarriären och rikta in sig på CNS hos både neonatala och vuxna möss51,52. Slutligen valdes AAV serotyp 2 på grund av dess förmåga att binda till heparin, vilket möjliggör affinitetskromatografi33. De renade rAAV1/2- och rAAV2/9-partiklarna kombinerar egenskaperna hos båda föräldrarnas AAV-serotyper och utgör därför lämpliga vektorer för transduktion av CNS 45,46,48,49.
Den snabbt växande AAV-vektorverktygslådan har blivit ett av de mest lovande genleveranssystemen för ett brett spektrum av celltyper genom olika administreringsvägar. I detta arbete syftade vi till att utveckla ett förbättrat protokoll för produktion, rening och karakterisering av mosaik-rAAV-vektorer som skulle kunna bevisa sitt värde i prekliniska studier. För detta ändamål beskrivs här genereringen av rAAV1/2- och rAAV2/9-mosaikvektorer, men proceduren kan också tillämpas för att rena standardvektorer för rAAV2 (data visas inte).
Mosaik rAAVs producerades efter en optimerad transfektionsmetod med PEI som transfektionsreagens. En transient transfektionsmetod valdes på grund av dess större flexibilitet och snabbhet, vilket är betydande fördelar i prekliniska studier i tidig fas. När en viss transgen och serotyp har validerats kan produktionssystemet finjusteras för att uppnå bättre skalbarhet och kostnadseffektivitet genom att etablera en stabil transfekterad cellinje som uttrycker en delmängd av de specifika Rep/Cap-generna , med ytterligare gener som tillhandahålls av en infektionsprocess24. Jämfört med kalcium-fosfattransfektion har PEI flera fördelar. Det är ett stabilt och kostnadseffektivt transfektionsreagens som fungerar effektivt inom ett bredare pH-område. Dessutom eliminerar det kravet på att byta cellmedium efter transfektion, vilket resulterar i en betydande minskning av både kostnader och arbetsbelastning69.
I ett försök att kringgå några av de begränsningar som CsCl- eller jodixanolgradienter medförde, skördades och renades de producerade rAAV:erna genom affinitetskromatografi. Denna strategi erbjuder ett förenklat och skalbart tillvägagångssätt som kan utföras utan behov av ultracentrifugering och gradienter, vilket ger rena och höga virala titrar. Faktum är att kromatografitekniker som använder ett FPLC-system kan automatiseras och skalas upp genom att packa mer hartsvolym i en kolonn med högre bäddhöjd. Protokollet som beskrivs häri kan enkelt anpassas för att inkludera 5 ml HiTrap Heparin HP-kolonner (data visas inte). Dessutom kan heparinkolonner återanvändas flera gånger, vilket bidrar till kostnadseffektiviteten för denna metod.
De renade rAAVerna karakteriserades sedan i termer av titer, renhet, morfologiska egenskaper och biologisk aktivitet. Intressant nog detekterades vid Coomassie blå färgning ett band med cirka 17 kDa i fraktionerna F8-F16 utöver de tre typiska virala kapsidproteinerna. Detta band är dock inte längre närvarande efter koncentrationssteget av rAAVs. Dessutom kan vissa svaga band med molekylvikter lägre än VP3 (<62 kDa) också detekteras vid B1- och A69-märkning, vilket tyder på att dessa kan vara fragment av kapsidproteinerna VP1, VP2 och VP370. En annan möjlighet är att dessa i själva verket är andra co-renande proteiner som ferritin eller andra cellulära proteiner med polypeptider som delar liknande proteinfingeravtryck med AAV-kapsidproteinerna och skulle kunna vara involverade i AAV-biologin, som tidigare föreslagits 26,71,72.
TEM- och bedövningsanalyser avslöjade också förekomsten av tomma partiklar på varierande nivåer i olika produktioner. På liknande sätt har andra studier tidigare rapporterat generering av variabla och höga nivåer (>65 %) av tomma kapsider för rAAVs framställda genom transfektions- eller infektionsmetoder24,73. Mekanismen bakom rAAV-generering börjar med den snabba bildningen av tomma kapsider från nyligen syntetiserade VP-proteiner, följt av ett långsamt hastighetsbegränsande steg av genompackning i de förformade kapsiderna medierade av Rep-proteiner74,75. Därför genereras tomma kapsider i rAAV-produktioner, även om andelen tomma och fulla kapsider kan variera beroende på storleken och sekvensen av den transgen av intresse och cellodlingsförhållanden58,73. Tomma kapsider ger upphov till vissa farhågor eftersom de, genom att sakna det aktuella genomet, inte kan ge en terapeutisk effekt och kan också potentiellt öka ett medfött eller adaptivt immunsvar. Vissa rapporter har dock också visat att, genom att justera deras förhållande, tomma AAV-kapsider kan fungera som mycket effektiva lockbeten för AAV-specifika neutraliserande antikroppar och därför öka transduktionseffektiviteten 60,76,77. Om närvaron av tomma kapsider är kritiskt skadlig och med tanke på den något mindre anjoniska karaktären hos tomma partiklar jämfört med fullvektorer, skulle en potentiell lösning kunna innebära att man genomför ett andra poleringsreningssteg med hjälp av anjonbyteskromatografitekniker64.
Denna studie ger också övertygande bevis för att de genererade mosaik-rAAVs effektivt kan transducera inte bara in vitro neuronala kulturer utan även CNS vid intrakraniell injektion av rAAV1/2. Sammantaget tyder dessa resultat på att det beskrivna produktions- och reningsprotokollet gör mycket rena och biologiskt aktiva rAAVs redo att användas inom 6 dagar, vilket presenterar sig som en mångsidig och kostnadseffektiv metod för generering av rAAVs i prekliniska studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för samarbetet, insikterna och den tekniska assistansen från Dr. Mónica Zuzarte, vid Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) och Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), angående TEM-analysen av rAAVs. Vi uttrycker vår uppskattning till Dr. Dominique Fernandes, vid Centrum för neurovetenskap och cellbiologi vid University of Coimbra (CNC-UC) och Institutet för tvärvetenskaplig forskning vid University of Coimbra (IIIUC), för hennes ovärderliga tekniska stöd och insikter om de primära neuronala kulturexperimenten. Plasmiderna pRV1, pH21 och pFdelta6, som är nödvändiga för denna studie, tillhandahölls generöst av Dr. Christina McClure, vid School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, vilket vi är tacksamma för. Detta arbete finansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden (Eruf) genom det regionala operativa programmet Centro 2020. genom det operativa programmet för konkurrenskraft och internationalisering COMPETE 2020 och portugisiska nationella medel via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, inom projekten: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet – IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Bekämpa Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); av American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) och Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT inom ramen för IMI2 JU Grant Agreement nr 945473 som stöds av EU och EFPIA, GeneT-Teaming Project 101059981 stöds av EU:s Horizon Europe-program. M.M.L. stöddes av 2021.05776.BD; C.H. stöddes av 2021.06939.BD; A.C.S. stöddes av 2020.07721.BD; och D.D.L. stöddes av 2020.09668.BD. Figur 1 skapades med hjälp av BioRender.com.
10% povidone-iodine | Medline | MDS093943 | |
12-well plates | Thermo Scientific | 11889684 | |
24-well plates | VWR | 734-2325 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
96-well Stunner plate | Unchained Labs | 701-2025 | 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 | Takara | 6233 | For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water |
Acetic acid glacial | Fisher Chemical | A/0360/PB17 | |
ÄKTA pure 25 | Cytiva | 29018224 | FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 |
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse | Invitrogen | 31328 | |
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC5100 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC9100 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | E1014 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | 184-5096 | |
ChemiDoc Touch Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 1708370 | |
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody | Abcam | ab13970 | |
Coomassie Blue G250 | Fisher Chemical | C/P541/46 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Bioreagents | BP17225 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Cytiva | RPN5785 | |
FastDigest SmaI | Thermo Scientific | FD0663 | |
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin | FEI | Biotwin | Transmission electron microscope |
Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
Fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Formvar-carbon coated 200 mesh grid | TAAB Laboratories Equipment | F077/025 | |
Gas evacuation apparatus | RWD | R546W | |
Glycerol | Fisher BioReagents | 10021083 | |
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 | Hamilton | 7803-07 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Hamilton | 7653-01 | |
HEK293T | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL | Cytiva | 17040701 | Pre-packed heparin column |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva | 17040601 | Pre-packed heparin column |
Immobilon-P PVDF Membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Isoflurane | Braun | 469860 | |
Ketamine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Nimatek |
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 11906965 | |
Lunatic & Stunner Client software | Unchained Labs | N/A | Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Methanol | Fisher Chemical | M/4000/FP21 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) | American Research Products | 03-61057 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) | American Research Products | 03-61058 | |
Neuro2a | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 12738422 | |
NZYColour Protein Marker II | NZYtech | MB09002 | |
pAAV-CMV-scGFP | Addgene | 32396 | Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396 |
pAAV-CMV-ssGFP | Addgene | 105530 | Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530 |
pAAV2/9n | Addgene | 112865 | Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865 |
Paraformaldehyde | Acros Organics | 10342243 | |
PBS | Fisher BioReagents | BP2438 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) | Gibco | 24040032 | |
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 | Polysciences Europe | 24765 | |
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane | RWD | N/A | |
Sample Inlet Valve V9-IS | Cytiva | 29027746 | |
Sample pump P9-S | Cytiva | 29027745 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10428420 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Bioreagents | BP166 | |
Sterile PVDF syringe filter | Fisher Scientific | 15191499 | |
Stunner Platform | Unchained Labs | 700-2002 | Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Superloop 150 mL | Cytiva | 18-1023-85 | |
Superloop 50 mL | Cytiva | 18-1113-82 | |
SURE 2 supercompetent cells | Stratagene, Agilent Technologies | HPA200152 | |
Treated culture dishes | Corning | 734-1711 | |
Tris base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tris hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 | Invitrogen | W21404 | |
Xylazine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Sedaxylan |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective |
Zeiss Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective |
Zeiss LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective |
µ-Slide 8 well Ibidi | Ibidi | 80826 | 8-well chamber slide |