यह पांडुलिपि एक अनुकूलित हेपरिन-आधारित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी विधि का उपयोग करके एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर की पीढ़ी और शुद्धि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। यह एक सरल, स्केलेबल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है। परिणामी वैक्टर उच्च शुद्धता और जैविक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उनके मूल्य को साबित करते हैं।
एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) विवो जीन वितरण के लिए एक तेजी से मूल्यवान वेक्टर बन गया है और वर्तमान में मानव नैदानिक परीक्षणों से गुजर रहा है। हालांकि, एएवी को शुद्ध करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके सीज़ियम क्लोराइड या आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते हैं। उनके फायदे के बावजूद, ये विधियां समय लेने वाली हैं, सीमित मापनीयता है, और अक्सर कम शुद्धता वाले वैक्टर का परिणाम होता है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, शोधकर्ता क्रोमैटोग्राफी तकनीकों पर अपना ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। यहां, हम एक अनुकूलित हेपरिन-आधारित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो एएवी के शुद्धिकरण के लिए एक सार्वभौमिक कैप्चर चरण के रूप में कार्य करता है।
यह विधि हेपरान सल्फेट प्रोटियोग्लाइकेन्स के लिए एएवी सीरोटाइप 2 (एएवी 2) की आंतरिक आत्मीयता पर निर्भर करती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एएवी 2 के उन लोगों के साथ वांछित एएवी कैप्सिड प्रोटीन एन्कोडिंग प्लास्मिड के सह-अभिकर्मक पर जोर देता है, मोज़ेक एएवी वैक्टर की उपज देता है जो माता-पिता के दोनों सीरोटाइप के गुणों को जोड़ते हैं। संक्षेप में, उत्पादक कोशिकाओं के लसीका के बाद, एएवी कणों वाले मिश्रण को एक मानक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करके एक अनुकूलित एकल-चरण हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल के बाद सीधे शुद्ध किया जाता है। शुद्ध एएवी कणों को बाद में केंद्रित किया जाता है और शुद्धता और जैविक गतिविधि के संदर्भ में व्यापक लक्षण वर्णन के अधीन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक सरलीकृत और स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्रेडिएंट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है, जिससे स्वच्छ और उच्च वायरल टाइटर्स मिलते हैं।
एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) वेक्टर वर्तमान जीन थेरेपी अध्ययनों में सबसे आशाजनक वितरण प्रणालियों में से एक के रूप में अपना रास्ता जीत रहा है। प्रारंभ में 19651 में पहचाना गया, एएवी एक छोटा, गैर-लिफाफा वाला वायरस है, जिसमें लगभग 25 एनएम व्यास का इकोसाहेड्रल प्रोटीन कैप्सिड होता है, जो एकल-फंसे डीएनए जीनोम को परेशान करता है। एएवी Parvoviridae परिवार और Dependoparvovirus जीनस के लिए एक सहायक वायरस के साथ सह संक्रमण पर उनकी अद्वितीय निर्भरता के कारण हैं, इस तरह के दाद सिंप्लेक्स वायरस या, अधिक बार, adenovirus, उनके lytic चक्र 2,3 को पूरा करने के लिए.
एएवी के 4.7 किलोबेस जीनोम में दो खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) होते हैं जो दो उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) से घिरे होते हैं जो विशेषता टी-आकार के हेयरपिन सिरोंको बनाते हैं। आईटीआर एएवी पैकेजिंग, प्रतिकृति और एकीकरण के लिए महत्वपूर्ण एकमात्र सीआईएस-अभिनय तत्व हैं, इसलिए पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी) वैक्टर में बनाए गए एकमात्र एएवी अनुक्रम हैं। इस प्रणाली में, वेक्टर उत्पादन के लिए आवश्यक जीन को ट्रांस में अलग से आपूर्ति की जाती है, जिससे ब्याज के जीन को वायरल कैप्सिड 5,6 के अंदर पैक किया जा सकता है।
प्रत्येक वायरल जीन वैकल्पिक स्प्लिसिंग के माध्यम से विभिन्न प्रोटीनों को संहिताबद्ध करता है और कोडन शुरू करता है। प्रतिनिधि ओआरएफ के भीतर, चार गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (Rep40, Rep52, Rep68, और Rep78) एन्कोडेड हैं, जो प्रतिकृति, साइट-विशिष्ट एकीकरण और वायरल डीएनए 7,8 के एनकैप्सिडेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कैप ओआरएफ अपने एन-टर्मिनस, (वीपी 1, वीपी 2, और वीपी 3) पर एक दूसरे से भिन्न तीन संरचनात्मक प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है, जो 1: 1: 10 4,9 के अनुपात में 60-मेर वायरल कैप्सिड बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं। इसके अतिरिक्त, एक गैर-पारंपरिक सीयूजी स्टार्ट कोडन के साथ कैप जीन में नेस्टेड एक वैकल्पिक ओआरएफ एक असेंबली-सक्रिय प्रोटीन (एएपी) को एन्कोड करता है। इस परमाणु प्रोटीन नव संश्लेषित कैप्सिड प्रोटीन VP1-3 के साथ बातचीत और कैप्सिड विधानसभा10,11 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है.
कैप्सिड खाते के अमीनो एसिड अनुक्रम में अंतर 11 स्वाभाविक रूप से होने वाली एएवी सीरोटाइप और मनुष्यों और गैर-मानव प्राइमेटऊतकों 7,12,13से अलग 100 से अधिक वेरिएंट के लिए खाते हैं। संरचनात्मक रूप से परिवर्तनशील क्षेत्रों के विरूपण में भिन्नताएं विभिन्न उपभेदों से कैप्सिड के विशिष्ट एंटीजेनिक गुणों और रिसेप्टर-बाध्यकारी विशिष्टताओं को नियंत्रित करती हैं। यह अलग ऊतक tropisms और विभिन्न स्तनधारी अंगों14 भर में पारगमन क्षमता में परिणाम.
आरएएवी के प्रारंभिक उत्पादन विधियां सहायक उद्देश्यों 15,16,17,18,19के लिए एडेनोवायरस संक्रमण पर निर्भर थीं। बड़े पैमाने पर कुशल और आमतौर पर उत्पादन करना आसान होने के बावजूद, इस संक्रमण से कई समस्याएं उत्पन्न होती हैं। शुद्धिकरण और निष्क्रियता के लिए एक गर्मी-विकृतीकरण कदम के बाद भी, एडेनोवायरल कण अभी भी एएवी तैयारी में मौजूद हो सकते हैं, जिससे अवांछित सुरक्षा समस्या20 बनती है। इसके अलावा, नैदानिक उपयोग के लिए विकृत एडेनोवायरल प्रोटीन की उपस्थिति अस्वीकार्य है। अन्य उत्पादन रणनीतियों पुनः संयोजक दाद सिंप्लेक्स वायरस उपभेदों का लाभ लेने के लिए इंजीनियर लक्ष्य कोशिकाओं21 या बैकुलोवायरस-कीट सेल प्रणाली22 में प्रतिनिधि / कैप और ट्रांसजीन लाने के लिए इंजीनियर है। यद्यपि ये सिस्टम स्केलेबिलिटी और जीएमपी संगतता के मामले में लाभ प्रदान करते हैं, फिर भी वे समान समस्याओं का सामना करते हैं।
आरएएवी उत्पादन के लिए ट्रिपल अभिकर्मक विधि आमतौर पर इन मुद्दों को आसानी से दूर करने के लिए अपनाई गई है। संक्षेप में, आरएएवी असेंबली तीन प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक पर निर्भर करती है: 1) जंगली प्रकार एएवी 2 जीनोम (पीआईटीआर) से आईटीआर के बीच पैक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति कैसेट; 2) प्रतिकृति और विषाणु विधानसभा (pAAV-RC) के लिए आवश्यक प्रतिनिधि / कैप अनुक्रम; और 3) हेल्पर प्रभाव (पीहेल्पर)6,20,23के लिए आवश्यक एडेनोवायरस वायरस से जुड़े आरएनए के साथ न्यूनतम एडेनोवायरल प्रोटीन (ई 1 ए, ई 1 बी, ई 4, और ई 2 ए)। जबकि प्लाज्मिड अभिकर्मक विधियां प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आरएएवी उत्पादन के लिए सादगी और लचीलापन प्रदान करती हैं, इन प्रक्रियाओं में बड़े पैमाने पर उत्पादन पर लागू होने पर स्केलेबिलिटी और प्रजनन क्षमता के संदर्भ में सीमाएं होती हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, आरएएवी उत्पादन एएवी निर्माता सेल लाइनों (दोनों पालन और निलंबन वृद्धि के) के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, वेक्टर निर्माणों के साथ संयोजन में एएवी प्रतिनिधि / कैप जीन या प्रतिनिधि / कैप को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। इन प्रणालियों में, एडेनोवायरल हेल्पर जीन को प्लास्मिड अभिकर्मक के माध्यम से पेश किया जाता है। हालांकि यह रणनीति सेल संस्कृति प्रक्रिया की मापनीयता में सुधार करती है, यह तकनीकी रूप से जटिल और समय लेने वाली 21,24,25है।
किसी भी मामले में, निर्माता कोशिकाओं को तब lysed किया जाता है और एक या कई शुद्धि चरणों के अधीन किया जाता है। वर्तमान में, आरएएवी को शुद्ध करने के प्रमुख तरीकों में सीज़ियम क्लोराइड (सीएससीएल) या आयोडिक्सानॉल अल्ट्रा-हाई स्पीड डेंसिटी ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग क्रोमैटोग्राफी तकनीकों द्वारा किया जाता है या नहीं,26. वायरल वर्षा के लिए मूल शुद्धिकरण योजना में अमोनियम सल्फेट का उपयोग किया गया था, इसके बाद सीएससीएल ढाल के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दो या तीन दौर थे। इस प्रक्रिया के मुख्य लाभों में सभी सीरोटाइप को शुद्ध करने की संभावना और उनके विभिन्न घनत्वों के आधार पर खाली कैप्सिड से पूर्ण कणों को शारीरिक रूप से अलग करने की क्षमता शामिल है। हालांकि, यह विधि विस्तृत, समय लेने वाली है, और इसमें सीमित मापनीयता है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर खराब उपज और कम नमूना गुणवत्ता 27,28,29,30होती है। इसके अलावा, एक शारीरिक बफर के खिलाफ डायलिसिस अक्सर विषाक्त प्रभाव के कारण विवो अध्ययन में आवश्यक होता है जो सीएससीएल स्तनधारियों पर डाल सकता है।
Iodixanol का उपयोग rAAV वैक्टर को शुद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक आइसो-आसमाटिक ढाल माध्यम के रूप में भी किया गया है, जिसमें सुरक्षा और वेक्टर शक्ति दोनों दृष्टिकोणों से CsCl पर फायदे हैं। हालांकि, सीएससीएल की तरह, आयोडिक्सानोल विधि सेल संस्कृति lysate (और इस प्रकार आरएएवी शुद्धि की मापनीयता) की लोडिंग क्षमता से संबंधित कुछ कमियां प्रस्तुत करता है और यह एक समय लेने वाली और महंगी विधि30,31 बनी हुई है.
इन बाधाओं को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने क्रोमैटोग्राफी तकनीकों पर अपना ध्यान केंद्रित किया। इस संबंध में, कई शुद्धिकरण दृष्टिकोण विकसित किए गए थे जो या तो आत्मीयता, हाइड्रोफोबिक या आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी विधियों को शामिल करते हैं। ये विधियां एक विशेष सीरोटाइप के जैव रासायनिक गुणों पर भरोसा करती हैं, जिसमें उनके प्राकृतिक रिसेप्टर्स, या वायरल कण32 की चार्ज विशेषताएं शामिल हैं। उदाहरण के लिए, खोज है कि AAV2, AAV3, AAV6, और AAV13 अधिमानतः हेपरान सल्फेट प्रोटियोग्लाइकेन्स (HSPG) से बंधते हैं, ने आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धि में निकटता से संबंधित हेपरिन का उपयोग करने की संभावना को खोल दिया। हालांकि, एचएसपीजी के लिए बाध्यकारी साइटें सीरोटाइप के बीच भिन्न हो सकती हैं, एएवी लगाव और लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण को अलग-अलग तरीकों से 2,33,34,35,36 में मध्यस्थता कर सकती हैं। दूसरी ओर, AAV1, AAV5, और AAV6 N-लिंक्ड सियालिक एसिड (SA) से बंधते हैं, जबकि AAV4 O-लिंक्ड SA 2,14,34 का उपयोग करता है। इसी तर्क के बाद, आरएएवी 5 की शुद्धि के लिए एक एकल-चरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल भी म्यूसिन के उपयोग के आधार पर विकसित किया गया है, एक स्तनधारी प्रोटीन जो एसए37 में अत्यधिक समृद्ध है। हेपरिन-आधारित तकनीकों की तरह, यह शुद्धिकरण भी उत्पन्न होने वाले विशिष्ट सीरोटाइप पर निर्भर है। हेपरिन और म्यूसिन के अलावा, ए20 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और कैमलिड सिंगल-डोमेन एंटीबॉडी (एवीबी सेफरोज और पोरोस कैप्चरसेलेक्ट )22,23,38,39,40,41जैसे आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए अन्य लिगेंड का पता लगाया गया है। पहले से मौजूद शुद्धिकरण विधियों को बेहतर बनाने के लिए अन्य नवीन रणनीतियों में विशिष्ट बाध्यकारी एपिटोप्स पेश करने के लिए आरएएवी कैप्सिड में छोटे संशोधनों की शुरूआत शामिल है। उदाहरण के लिए, हेक्सा-हिस्टिडाइन-टैग या बायोटिनिलेटेड आरएएवी को लिगैंड का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है जो उन एपिटोप्स (निकल नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड और एविडिन रेजिन, क्रमशः)42,43,44को लक्षित करते हैं।
आरएएवी की वांछित विशेषताओं को व्यापक बनाने के प्रयास में, जांचकर्ताओं ने अपने कैप्सिड को मिलाकर विषाणुओं को क्रॉस-ड्रेस किया है। यह उत्पादन के दौरान सममोलर या अलग-अलग अनुपात में दो अलग-अलग एएवी सीरोटाइप से कैप्सिड जीन की आपूर्ति करके पूरा किया जाता है, जिससे विभिन्न सीरोटाइप 34,45,46,47,48,49,50 से कैप्सिड सबयूनिट्स के मिश्रण से बना कैप्सिड संरचना को जन्म मिलता है. पिछले अध्ययन भौतिक साक्ष्य प्रदान करते हैं कि AAV2 से AAV1 (1:1 अनुपात) और AAV2 के साथ AAV9 (1:1 अनुपात) के साथ सह-व्यक्त कैप्सिड प्रोटीन के परिणामस्वरूप क्रमशः मोज़ेक rAAV1/2 और rAAV2/9 वैक्टर की पीढ़ी होती है, क्रमशः 45,46,48। मोज़ेक आरएएवी की पीढ़ी का एक प्रमुख लाभ विभिन्न एएवी सीरोटाइप से लाभप्रद लक्षणों को एकीकृत करने की क्षमता है, जिसके परिणामस्वरूप आरएएवी उत्पादन के दौरान उपयोगी अन्य गुणों को बनाए रखते हुए ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और ट्रोपिज्म में सहक्रियात्मक सुधार होता है। दिलचस्प बात यह है कि कुछ मोज़ेक वेरिएंट भी माता-पिता के वायरस 46,47,49से अलग उपन्यास गुण प्रदर्शित करते हैं। AAV2 की हेपरिन-बाइंडिंग क्षमता का लाभ उठाकर, मोज़ेक rAAV वैक्टर संभावित रूप से AAV2 को निर्देशित विकास और/या तर्कसंगत डिज़ाइन द्वारा उत्पन्न अन्य प्राकृतिक या नए AAV कैप्सिड के साथ मिलाकर उत्पन्न और शुद्ध किया जा सकता है। बहरहाल, पिछले अध्ययनों ने मोज़ेक वैक्टर को इकट्ठा करने का प्रयास करते समय कैप्सिड सबयूनिट संगतता के महत्व पर प्रकाश डाला है। उदाहरण के लिए, राबिनोविट्ज़ और सहकर्मियों ने प्रदर्शित किया कि हालांकि AAV1, AAV2, और AAV3 के ट्रांसकैप्सिडेशन ने मोज़ेक कैप्सिड की एक कुशल सह-असेंबली का नेतृत्व किया, AAV4 के साथ इन सीरोटाइप के क्रॉस-ड्रेसिंग ने स्थिर विषाणुओं की पीढ़ी 34,45,47 में बाधा डाली। इसके अतिरिक्त, AAV1, AAV2, और AAV3 ने AAV5 के साथ कम संगतता दिखाई, इन कैप्सिड को अलग-अलग अनुपात में मिलाते समय प्राप्त कम वायरल टाइटर्स को देखते हुए। दिलचस्प बात यह है कि मोज़ेक आरएएवी 2/5 ने हेपरिन-बाध्यकारी गुणों में कमी दिखाई, जबकि माता-पिता के एएवी 5 की तरह म्यूसिन-बाइंडिंग क्षमता को बनाए रखा। हालांकि, 3: 1 अनुपात में आरएएवी 3/5 ने हेपरिन और म्यूसिन के दोहरे बंधन को संरक्षित किया। कुल मिलाकर, बढ़ाया पारगमन, विशिष्ट ट्रोपिज्म, या कम इम्युनोजेनेसिटी के साथ नए मोज़ेक आरएएवी की पीढ़ी कैप्सिड असेंबली और रिसेप्टर इंटरैक्शन की हमारी समझ से बहुत लाभ उठा सकती है, विशिष्ट संयोजनों के साथ अभी भी पूरी तरह से जांच और अनुकूलन की आवश्यकता है।
वर्तमान कार्य में, हम एक अनुकूलित हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी विधि का उपयोग करके आरएएवी के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। आरएएवी क्षणिक अभिकर्मक द्वारा निर्मित होते हैं और एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध होते हैं। चयनित शुद्ध अंशों की एकाग्रता के बाद, परिणामी वायरल स्टॉक को टिटर, शुद्धता, आंतरिक भौतिक गुणों और जैविक गतिविधि के संदर्भ में इन विट्रो और विवो में विशेषता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम मोज़ेक rAAV1/2 और rAAV2/9 वैक्टर की पीढ़ी के लिए इस प्रोटोकॉल के सुधार और प्रयोज्यता का प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक सीरोटाइप की पसंद उनके हड़ताली अलग-अलग ट्रॉपिज्म पर आधारित थी, संभावित रूप से मोज़ेक संस्करणों के लिए भी उनकी अनूठी विशेषताओं को प्रदान करती थी। एएवी सीरोटाइप 1, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए एक समग्र मध्यम ट्रोपिज्म के साथ, न्यूरॉन्स और ग्लिया (कुछ हद तक) को ट्रांसड्यूस करने की क्षमता है और विवो 2,7,8में एंटरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में अक्षीय परिवहन से गुजरता है। इसके अतिरिक्त, एएवी सीरोटाइप 9 रक्त मस्तिष्क बाधा पार और नवजात और वयस्क चूहों51,52 दोनों में सीएनएस लक्ष्य करने के लिए अपनी प्राकृतिक क्षमता के लिए चुना गया था. अंत में, एएवी सीरोटाइप 2 को हेपरिन से बांधने की क्षमता दी गई थी, जिससे एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी33 की अनुमति मिली। शुद्ध आरएएवी 1/2 और आरएएवी 2/9 कण माता-पिता एएवी सीरोटाइप दोनों के गुणों को जोड़ते हैं और इसलिए, सीएनएस45,46,48,49के पारगमन के लिए उपयुक्त वैक्टर का गठन करते हैं।
तेजी से विस्तार करने वाला एएवी वेक्टर टूलकिट प्रशासन के विभिन्न मार्गों के माध्यम से सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सबसे आशाजनक जीन वितरण प्रणालियों में से एक बन गया है। इस काम में, हमने मोज़ेक आरएएवी वैक्टर के उत्पादन, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित करने का लक्ष्य रखा है जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उनके मूल्य को साबित कर सकता है। उस प्रयोजन के लिए, rAAV1/2 और rAAV2/9 मोज़ेक वैक्टर की पीढ़ी यहाँ वर्णित है, लेकिन प्रक्रिया भी मानक rAAV2 वैक्टर (डेटा नहीं दिखाया गया) शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है.
मोज़ेक आरएएवी को एक अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में पीईआई का उपयोग करके एक अनुकूलित अभिकर्मक विधि के बाद उत्पादित किया गया था। एक क्षणिक अभिकर्मक विधि अपने अधिक से अधिक लचीलापन और गति, प्रारंभिक चरण पूर्व नैदानिक अध्ययन में काफी फायदे के कारण चुना गया था. एक बार एक विशेष ट्रांसजीन और सीरोटाइप मान्य किया गया है, उत्पादन प्रणाली ठीक ट्यून किया जा सकता है एक स्थिर ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन है कि विशिष्ट प्रतिनिधि / कैप जीन के एक सबसेट व्यक्त की स्थापना के द्वारा बेहतर मापनीयता और लागत प्रभावशीलता प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त जीन के साथ एक संक्रमण प्रक्रिया24 द्वारा प्रदान की जाती है. कैल्शियम-फॉस्फेट अभिकर्मक की तुलना में, पीईआई कई फायदे प्रस्तुत करता है। यह एक स्थिर और लागत प्रभावी अभिकर्मक अभिकर्मक है जो व्यापक पीएच रेंज के भीतर प्रभावी ढंग से संचालित होता है। इसके अतिरिक्त, यह अभिकर्मक के बाद सेल माध्यम को बदलने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप लागत और कार्यभार दोनों में उल्लेखनीय कमीआती है।
CsCl या iodixanol ग्रेडिएंट द्वारा लगाई गई कुछ सीमाओं को दरकिनार करने के प्रयास में, उत्पादित rAAV को एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा काटा और शुद्ध किया गया था। यह रणनीति एक सरलीकृत और स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करती है जिसे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्रेडिएंट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है, जिससे स्वच्छ और उच्च वायरल टाइटर्स मिलते हैं। दरअसल, एफपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफी तकनीकों को स्वचालित किया जा सकता है और उच्च बिस्तर ऊंचाई वाले कॉलम में अधिक राल मात्रा पैक करके बढ़ाया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 5 एमएल हाईट्रैप हेपरिन एचपी कॉलम (डेटा नहीं दिखाया गया) को शामिल करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हेपरिन कॉलम को कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है, इस प्रकार इस पद्धति की लागत-प्रभावशीलता में योगदान होता है।
शुद्ध आरएएवी को तब अनुमापक, शुद्धता, रूपात्मक विशेषताओं और जैविक गतिविधि के संदर्भ में चित्रित किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि कूमासी ब्लू स्टेनिंग में, लगभग 17 केडीए वाला एक बैंड तीन विशिष्ट वायरल कैप्सिड प्रोटीन के अलावा अंशों एफ 8-एफ 16 में पाया गया था। हालांकि, यह बैंड आरएएवी के एकाग्रता चरण के बाद मौजूद नहीं है। इसके अलावा, वीपी 3 (<62 केडीए) से कम आणविक भार वाले कुछ बेहोश बैंड भी बी 1 और ए 69 लेबलिंग पर पता लगाया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि ये वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 कैप्सिड प्रोटीन70 के टुकड़े हो सकते हैं। एक और संभावना यह है कि ये वास्तव में पॉलीपेप्टाइड्स के साथ फेरिटिन या अन्य सेलुलर प्रोटीन जैसे अन्य सह-शुद्ध प्रोटीन हैं जो एएवी कैप्सिड प्रोटीन के साथ समान प्रोटीन फिंगरप्रिंट साझा करते हैं और एएवी जीव विज्ञान में शामिल हो सकते हैं, जैसा कि पहले 26,71,72का सुझाव दिया गया था।
टीईएम और स्टनर विश्लेषण ने विभिन्न प्रस्तुतियों में चर स्तरों पर खाली कणों की उपस्थिति का भी खुलासा किया। इसी तरह, अन्य अध्ययनों से पहले अभिकर्मक या संक्रमण विधियों24,73 द्वारा तैयार rAAV के लिए खाली capsids के चर और उच्च स्तर (>65%) की पीढ़ी की सूचना दी. आरएएवी पीढ़ी के पीछे तंत्र नए संश्लेषित वीपी प्रोटीन से खाली कैप्सिड के तेजी से गठन के साथ शुरू होता है, इसके बाद रेप प्रोटीन74,75 द्वारा मध्यस्थता वाले पूर्ववर्ती कैप्सिड में जीनोम पैकेजिंग की धीमी दर-सीमित कदम होता है। इसलिए, खाली कैप्सिड आरएएवी प्रस्तुतियों में उत्पन्न होते हैं, हालांकि खाली और पूर्ण कैप्सिड का अनुपात ब्याज और सेल संस्कृति की स्थिति 58,73के ट्रांसजीन के आकार और अनुक्रम के आधार पर भिन्न हो सकता है। खाली कैप्सिड कुछ चिंताओं को उठाते हैं, क्योंकि ब्याज के जीनोम की कमी से, वे एक चिकित्सीय प्रभाव प्रदान करने में असमर्थ हैं और संभावित रूप से एक जन्मजात या अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भी बढ़ा सकते हैं। हालांकि, कुछ रिपोर्टों से यह भी पता चला है कि, उनके अनुपात को समायोजित करके, खाली एएवी कैप्सिड एएवी-विशिष्ट न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी के लिए अत्यधिक प्रभावी डिकॉय के रूप में काम कर सकते हैं और इसलिए, पारगमन क्षमता60,76,77में वृद्धि कर सकते हैं। यदि खाली कैप्सिड की उपस्थिति गंभीर रूप से हानिकारक है और पूर्ण वैक्टर की तुलना में खाली कणों के थोड़ा कम आयनिक चरित्र को देखते हुए, एक संभावित समाधान में आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी तकनीकों64का उपयोग करके एक दूसरा चमकाने शुद्धिकरण चरण का संचालन करना शामिल हो सकता है।
यह अध्ययन सम्मोहक साक्ष्य भी प्रदान करता है कि उत्पन्न मोज़ेक आरएएवी न केवल इन विट्रो न्यूरोनल संस्कृतियों में बल्कि आरएएवी 1/2 के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन पर सीएनएस को कुशलतापूर्वक प्रसारित करने में सक्षम हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि वर्णित उत्पादन और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल 6 दिनों में उपयोग करने के लिए तैयार अत्यधिक शुद्ध और जैविक रूप से सक्रिय आरएएवी प्रदान करता है, जो खुद को प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आरएएवी की पीढ़ी के लिए एक बहुमुखी और लागत प्रभावी विधि के रूप में पेश करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम आरएएवी के टीईएम विश्लेषण के संबंध में कोयम्बरा इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड बायोमेडिकल रिसर्च (आईसीबीआर) और सेंटर फॉर इनोवेटिव बायोमेडिसिन एंड बायोटेक्नोलॉजी (सीआईबीबी) में डॉ. मोनिका ज़ुज़ार्टे द्वारा प्रदान किए गए सहयोग, अंतर्दृष्टि और तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम कोयम्बरा विश्वविद्यालय (सीएनसी-यूसी) के सेंटर फॉर न्यूरोसाइंस एंड सेल बायोलॉजी और कोयम्बरा विश्वविद्यालय (IIIUC) के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान में डॉ. डोमिनिक फर्नांडीस को उनकी अमूल्य तकनीकी सहायता और अंतर्दृष्टि के लिए अपनी प्रशंसा का विस्तार करते हैं। इस अध्ययन के लिए आवश्यक pRV1, pH21, और pFdelta6 प्लास्मिड, स्कूल ऑफ मेडिकल साइंसेज, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंसेज एंड मेडिसिन, एबरडीन विश्वविद्यालय में डॉ. क्रिस्टीना मैकक्लर द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किए गए थे, जिसके लिए हम आभारी हैं। इस काम को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) द्वारा सेंट्रो 2020 क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था; COMPETE 2020 के माध्यम से – प्रतिस्पर्धात्मकता और अंतर्राष्ट्रीयकरण के लिए परिचालन कार्यक्रम, और FCT के माध्यम से पुर्तगाली राष्ट्रीय निधि – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, परियोजनाओं के तहत: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), रीसेट – IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), फाइटिंग Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); अमेरिकन पुर्तगाली बायोमेडिकल रिसर्च फंड (APBRF) और रिचर्ड चिन और लिली लॉक मचाडो-जोसेफ डिजीज रिसर्च फंड, ARDAT द्वारा IMI2 JU ग्रांट एग्रीमेंट No 945473 के तहत EU और EFPIA द्वारा समर्थित; जीन-टीमिंग प्रोजेक्ट यूरोपीय संघ के क्षितिज यूरोप कार्यक्रम द्वारा समर्थित 101059981। एमएमएल 2021.05776.BD द्वारा समर्थित था; सीएच को 2021.06939.BD द्वारा समर्थित किया गया था; ए.सी.एस. 2020.07721.BD द्वारा समर्थित किया गया था; और डीडीएल 2020.09668.BD द्वारा समर्थित किया गया था चित्रा 1 BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
10% povidone-iodine | Medline | MDS093943 | |
12-well plates | Thermo Scientific | 11889684 | |
24-well plates | VWR | 734-2325 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
96-well Stunner plate | Unchained Labs | 701-2025 | 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 | Takara | 6233 | For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water |
Acetic acid glacial | Fisher Chemical | A/0360/PB17 | |
ÄKTA pure 25 | Cytiva | 29018224 | FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 |
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse | Invitrogen | 31328 | |
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC5100 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC9100 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | E1014 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | 184-5096 | |
ChemiDoc Touch Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 1708370 | |
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody | Abcam | ab13970 | |
Coomassie Blue G250 | Fisher Chemical | C/P541/46 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Bioreagents | BP17225 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Cytiva | RPN5785 | |
FastDigest SmaI | Thermo Scientific | FD0663 | |
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin | FEI | Biotwin | Transmission electron microscope |
Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
Fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Formvar-carbon coated 200 mesh grid | TAAB Laboratories Equipment | F077/025 | |
Gas evacuation apparatus | RWD | R546W | |
Glycerol | Fisher BioReagents | 10021083 | |
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 | Hamilton | 7803-07 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Hamilton | 7653-01 | |
HEK293T | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL | Cytiva | 17040701 | Pre-packed heparin column |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva | 17040601 | Pre-packed heparin column |
Immobilon-P PVDF Membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Isoflurane | Braun | 469860 | |
Ketamine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Nimatek |
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 11906965 | |
Lunatic & Stunner Client software | Unchained Labs | N/A | Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Methanol | Fisher Chemical | M/4000/FP21 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) | American Research Products | 03-61057 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) | American Research Products | 03-61058 | |
Neuro2a | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 12738422 | |
NZYColour Protein Marker II | NZYtech | MB09002 | |
pAAV-CMV-scGFP | Addgene | 32396 | Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396 |
pAAV-CMV-ssGFP | Addgene | 105530 | Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530 |
pAAV2/9n | Addgene | 112865 | Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865 |
Paraformaldehyde | Acros Organics | 10342243 | |
PBS | Fisher BioReagents | BP2438 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) | Gibco | 24040032 | |
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 | Polysciences Europe | 24765 | |
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane | RWD | N/A | |
Sample Inlet Valve V9-IS | Cytiva | 29027746 | |
Sample pump P9-S | Cytiva | 29027745 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10428420 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Bioreagents | BP166 | |
Sterile PVDF syringe filter | Fisher Scientific | 15191499 | |
Stunner Platform | Unchained Labs | 700-2002 | Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Superloop 150 mL | Cytiva | 18-1023-85 | |
Superloop 50 mL | Cytiva | 18-1113-82 | |
SURE 2 supercompetent cells | Stratagene, Agilent Technologies | HPA200152 | |
Treated culture dishes | Corning | 734-1711 | |
Tris base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tris hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 | Invitrogen | W21404 | |
Xylazine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Sedaxylan |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective |
Zeiss Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective |
Zeiss LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective |
µ-Slide 8 well Ibidi | Ibidi | 80826 | 8-well chamber slide |