زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في هيدروجيل مع زيادة التعديل الحيوي الضوئي
Summary
نقدم هنا بروتوكولا يوضح استخدام الهيدروجيل كإطار زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) لثقافة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSC) وإدخال التعديل الحيوي الضوئي (PBM) لتعزيز انتشار ADSCs في بيئة الثقافة ثلاثية الأبعاد.
Abstract
غالبا ما تستخدم الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) ، التي تمتلك خصائص اللحمة المتوسطة متعددة القدرات المشابهة للخلايا الجذعية ، في الطب التجديدي نظرا لقدرتها على مجموعة متنوعة من تمايز الخلايا وقدرتها على تعزيز الهجرة والانتشار وتخفيف الالتهاب. ومع ذلك، غالبا ما تواجه كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي تحديات في البقاء على قيد الحياة والنقش داخل الجروح، ويرجع ذلك أساسا إلى الظروف الالتهابية غير المواتية. ولمعالجة هذه المشكلة، تم تطوير الهلاميات المائية للحفاظ على صلاحية كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSC) في الجروح وتسريع عملية التئام الجروح. هنا، نهدف إلى تقييم التأثير التآزري للتعديل الحيوي الضوئي (PBM) على انتشار ADSC والسمية الخلوية ضمن إطار زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تم زرع كاليستيدات المعالجة المعمقة في هلاميات مائية سعة 10 ميكرولتر بكثافة 2.5 × 103 خلايا وتعرضت للإشعاع باستخدام ثنائيات 525 نانومتر و825 نانومتر عند طلاقة 5 جول / سم2 و 10 جول / سم2. تم تقييم التغيرات المورفولوجية والسمية الخلوية والانتشار في 24 ساعة و 10 أيام بعد التعرض ل PBM. أظهرت ADSCs مورفولوجيا مستديرة وتم توزيعها في جميع أنحاء الهلام كخلايا فردية أو مجاميع كروية. الأهم من ذلك ، أن كلا من إطار زراعة PBM و 3D لم يظهرا أي تأثيرات سامة للخلايا على الخلايا ، في حين أن PBM عزز بشكل كبير معدلات انتشار ADSCs. في الختام، توضح هذه الدراسة استخدام الهيدروجيل كبيئة ثلاثية الأبعاد مناسبة لثقافة كؤوس التفاضل التفاضلي (ADSC) وتقدم PBM كاستراتيجية تعزيز مهمة، لا سيما معالجة معدلات الانتشار البطيئة المرتبطة بزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.
Introduction
ADSCs هي خلايا سلفية متعددة القدرات وسيطة لها القدرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى عدة سلالات خلوية. يمكن حصاد هذه الخلايا من الجزء الوعائي اللحمي (SVF) للأنسجة الدهنية أثناء إجراء شفط الدهون1. برزت كالتي تفاضل التفاضل التفاضلي (ADSCs) كنوع مثالي من الخلايا الجذعية لاستخدامها في الطب التجديدي لأن هذه الخلايا وفيرة، وطفيفة التوغل للحصاد، ويمكن الوصول إليها بسهولة، وتتميز بشكل جيد2. يوفر العلاج بالخلايا الجذعية وسيلة ممكنة لالتئام الجروح عن طريق تحفيز هجرة الخلايا وتكاثرها والأوعية الدموية الجديدة وتقليل الالتهاب داخل الجروح 3,4. ويعزى ما يقرب من 80٪ من القدرة التجديدية ل ADSCs إلى إشارات الباراكرين عبر إفرازها5. في السابق ، تم اقتراح الحقن المحلي المباشر للخلايا الجذعية أو عوامل النمو في الأنسجة التالفة يمكن أن يكون غير مشروع بما يكفي في آليات إصلاح الجسم الحي 6،7،8. ومع ذلك ، واجه هذا النهج العديد من التحديات ، مثل ضعف البقاء على قيد الحياة وانخفاض تطعيم الخلايا الجذعية داخل الأنسجة التالفة نتيجة للبيئة الالتهابية 9. علاوة على ذلك ، كان أحد الأسباب المذكورة هو عدم وجود مصفوفة خارج الخلية لدعم بقاء ووظائف الخلايا المزروعة10. للتغلب على هذه التحديات ، يتم التركيز الآن على تطوير ناقلات المواد الحيوية لدعم صلاحية الخلايا الجذعية ووظيفتها.
تعمل ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) على تحسين التفاعل من خلية إلى خلية ومن خلية إلى مصفوفة في المختبر لتوفير بيئة تشبه بشكل أفضل البيئة في الجسم الحي 11. تمت دراسة الهلاميات المائية على نطاق واسع كفئة من ناقلات المواد الحيوية التي توفر بيئة 3D لزراعة الخلايا الجذعية. هذه الهياكل مصنوعة من الماء والبوليمرات المتشابكة12. إن تغليف كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) في هيدروجيل ليس له أي تأثير سام للخلايا على الخلايا أثناء الزرع مع الحفاظ على صلاحية الخلايا6. تظهر الخلايا الجذعية المزروعة في 3D احتفاظا معززا بجذعها وقدرة تمايزمحسنة 13. وبالمثل، أظهرت كالوريدات المعالجة بالهلام الكهروضوئي المنشط (ADSCs) البذرية المائية زيادة في الصلاحية وسرعة إغلاق الجرح في النماذج الحيوانية14. علاوة على ذلك، يزيد تغليف الهيدروجيل بشكل كبير من النقش والاحتفاظ ب ADSCs في الجروح15,16. يتكون TrueGel3D من بوليمر ، إما كحول بولي فينيل أو ديكستران ، متصلب بواسطة رابط متشابك ، إما سيكلوديكسترين أو بولي إيثيلين جلايكول17. الجل عبارة عن هيدروجيل اصطناعي لا يحتوي على أي منتجات حيوانية قد تتداخل مع التجارب أو تؤدي إلى رد فعل مناعي أثناء زرع الجل في المريض بينما تحاكي بشكل فعال مصفوفة خارج الخلية18. الجل قابل للتخصيص بالكامل عن طريق تغيير التكوين والمكونات الفردية. يمكن أن يضم خلايا جذعية مختلفة ويدعم تمايز عدة أنواع من الخلايا عن طريق ضبط صلابة الجل19. يمكن إنشاء مواقع المرفقات من خلال إضافة الببتيدات20. الجل قابل للتحلل عن طريق إفراز ميتالوبروتياز ، مما يسمح بهجرة الخلايا21. أخيرا ، إنه واضح ويسمح بتقنيات التصوير.
PBM هو شكل طفيف التوغل ويمكن تنفيذه بسهولة من العلاج بالليزر منخفض المستوى يستخدم لتحفيز الكروموفورات داخل الخلايا. الأطوال الموجية المختلفة تثير تأثيرات مختلفة على الخلايا22. يحفز الضوء في النطاق الأحمر إلى القريب من الأشعة تحت الحمراء زيادة إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عن طريق تعزيز التدفق عبر سلسلة نقل الإلكترون23. يحفز الضوء في النطاقات الزرقاء والخضراء القنوات الأيونية ذات البوابات الضوئية ، مما يسمح بالتدفق غير المحدد للكاتيونات ، مثل الكالسيوم والمغنيسيوم ، إلى الخلايا ، والذي يعرف بتعزيز التمايز24. التأثير الصافي هو توليد رسل ثانوي يحفز نسخ العوامل التي تؤدي إلى العمليات الخلوية النهائية مثل الهجرة والانتشار والتمايز25. يمكن استخدام PBM لتهيئة الخلايا مسبقا للتكاثر أو التمايز قبل زرع الخلايا في بيئة معاكسة ، على سبيل المثال ، الأنسجة التالفة26. أدى التعرض ل PBM قبل وبعد الزرع (630 نانومتر و 810 نانومتر) ل ADSCs إلى تعزيز صلاحية ووظيفة هذه الخلايا في الجسم الحي في نموذجالفئران السكري 27. يتطلب الطب التجديدي عددا كافيا من الخلايا لإصلاح الأنسجة بشكل فعال28. في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، ارتبطت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي بمعدلات انتشار أبطأ مقارنة بزراعة الخلاياثنائية الأبعاد 6. ومع ذلك ، يمكن استخدام PBM لزيادة عملية زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ل ADSCs من خلال تعزيز الجدوى والانتشار والهجرة والتمايز29,30.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) نوعا مثاليا من الخلايا لاستخدامها في الطب التجديدي لأنها تحفز العمليات المختلفة للمساعدة في التئام الجروح 3,4. ومع ذلك ، هناك العديد من التحديات التي يجب التحايل عليها ، على سبيل المثال ، معدلات البقاء على قيد الحياة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب أفريقيا Thuthuka Instrument ، رقم المنحة TTK2205035996 ؛ وزارة العلوم والابتكار (DSI) بتمويل من المركز الأفريقي لليزر (ALC) ، رقم المنحة HLHA23X المهمة ALC-R007 ؛ مجلس البحوث الجامعية ، رقم المنحة 2022URC00513 ؛ مبادرة كراسي البحث في جنوب إفريقيا التابعة لوزارة العلوم والتكنولوجيا (DST-NRF / SARChI) ، رقم المنحة 98337. لم تلعب هيئات التمويل أي دور في تصميم الدراسة أو الجمع أو التحليل أو تفسير البيانات أو كتابة المخطوطة. يشكر المؤلفون جامعة جوهانسبرغ (UJ) ومركز أبحاث الليزر (LRC) على استخدامهم للمرافق والموارد.
Materials
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
