Culture cellulaire tridimensionnelle de cellules souches dérivées du tissu adipeux dans un hydrogel avec augmentation de la photobiomodulation

Summary

Ici, nous présentons un protocole démontrant l’utilisation de l’hydrogel comme cadre de culture cellulaire tridimensionnel (3D) pour la culture de cellules souches dérivées adipeuses (ADSC) et introduisant la photobiomodulation (PBM) pour améliorer la prolifération des ADSC dans le cadre de la culture 3D.

Abstract

Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC), possédant des caractéristiques mésenchymateuses multipotentes semblables à celles des cellules souches, sont fréquemment utilisées en médecine régénérative en raison de leur capacité à diversifier les cellules et à améliorer la migration, la prolifération et atténuer l’inflammation. Cependant, les ADSC sont souvent confrontés à des défis de survie et de greffe dans les plaies, principalement en raison de conditions inflammatoires défavorables. Pour résoudre ce problème, des hydrogels ont été développés pour maintenir la viabilité de l’ADSC dans les plaies et accélérer le processus de cicatrisation des plaies. Ici, nous avons cherché à évaluer l’impact synergique de la photobiomodulation (PBM) sur la prolifération et la cytotoxicité des ADSC dans un cadre de culture cellulaire 3D. Les ADSC immortalisés ont été ensemencés dans des hydrogels de 10 μL à une densité de 2,5 x 10³ cellules et soumis à une irradiation à l’aide de diodes de 525 nm et 825 nm à des fluidités de 5 J/cm² et 10 J/cm². Les changements morphologiques, la cytotoxicité et la prolifération ont été évalués 24 heures et 10 jours après l’exposition au PBM. Les ADSC présentaient une morphologie arrondie et étaient dispersées dans le gel sous forme de cellules individuelles ou d’agrégats sphéroïdes. Il est important de noter que le PBM et le cadre de culture 3D n’ont montré aucun effet cytotoxique sur les cellules, tandis que le PBM a considérablement augmenté les taux de prolifération des ADSC. En conclusion, cette étude démontre l’utilisation de l’hydrogel comme environnement 3D approprié pour la culture ADSC et présente la PBM comme une stratégie d’augmentation significative, en particulier pour traiter les taux de prolifération lents associés à la culture cellulaire 3D.

Introduction

Les ADSC sont des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes ayant la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en plusieurs lignées cellulaires. Ces cellules peuvent être prélevées à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux lors d’une procédure de lipoaspiration¹. Les ADSC sont apparus comme un type de cellules souches idéal à utiliser en médecine régénérative car ces cellules sont abondantes, peu invasives à récolter, facilement accessibles et bien caractérisées². La thérapie par cellules souches offre une voie possible pour la cicatrisation des plaies en stimulant la migration cellulaire, la prolifération, la néovascularisation et la réduction de l’inflammation dans les plaies ^3,4. Environ 80 % de la capacité de régénération des ADSC est attribuable à la signalisation paracrine via leur sécrétome⁵. Auparavant, il avait été suggéré qu’une injection locale directe de cellules souches ou de facteurs de croissance dans les tissus endommagés pourrait entraîner des mécanismes de réparation in vivo suffisants ^6,7,8. Cependant, cette approche a été confrontée à plusieurs défis, tels qu’une faible survie et une réduction de la greffe de cellules souches dans les tissus endommagés en raison de l’environnement inflammatoire ⁹. De plus, l’une des raisons citées était l’absence d’une matrice extracellulaire pour soutenir la survie et la fonctionnalité des cellules transplantées¹⁰. Pour surmonter ces défis, l’accent est maintenant mis sur le développement de supports de biomatériaux pour soutenir la viabilité et la fonction des cellules souches.

La culture cellulaire tridimensionnelle (3D) améliore l’interaction entre cellules et entre cellules et matrices in vitro pour fournir un environnement qui ressemble davantage à l’environnement in vivo ¹¹. Les hydrogels ont été largement étudiés en tant que classe de supports de biomatériaux qui fournissent un environnement 3D pour la culture de cellules souches. Ces structures sont constituées d’eau et de polymères réticulés¹². L’encapsulation des ADSC dans de l’hydrogel n’a pratiquement aucun effet cytotoxique sur les cellules pendant la culture tout en maintenant la viabilité des cellules⁶. Les cellules souches cultivées en 3D démontrent une meilleure conservation de leur souche et une meilleure capacité de différenciation¹³. De même, les ADSC ensemencés en hydrogel ont démontré une viabilité accrue et une fermeture accélérée de la plaie dans des modèles animaux¹⁴. De plus, l’encapsulation d’hydrogel augmente considérablement la prise de greffe et la rétention des ADSC dans les plaies^15,16. TrueGel3D est composé d’un polymère, soit de l’alcool polyvinylique ou du dextran, solidifié par un agent de réticulation, soit de la cyclodextrine ou du polyéthylène glycol¹⁷. Le gel est un hydrogel synthétique qui ne contient aucun produit animal susceptible d’interférer avec les expériences ou de déclencher une réaction immunitaire lors de la transplantation du gel chez un patient tout en imitant efficacement une matrice extracellulaire¹⁸. Le gel est entièrement personnalisable en modifiant la composition et les composants individuels. Il peut abriter différentes cellules souches et soutenir la différenciation de plusieurs types de cellules en ajustant la rigidité du gel¹⁹. Des sites d’attache peuvent être créés par l’ajout de peptides²⁰. Le gel est dégradable par la sécrétion de métalloprotéases, permettant la migration cellulaire²¹. Enfin, il est clair et permet des techniques d’imagerie.

La PBM est une forme de thérapie au laser de faible intensité peu invasive et facile à réaliser utilisée pour stimuler les chromophores intracellulaires. Différentes longueurs d’onde provoquent des effets différents sur les cellules²². La lumière dans la gamme du rouge au proche infrarouge stimule la production accrue d’adénosine triphosphate (ATP) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) en améliorant le flux à travers la chaîne de transport d’électrons²³. La lumière dans les gammes bleue et verte stimule les canaux ioniques photodépendants, permettant l’afflux non spécifique de cations, tels que le calcium et le magnésium, dans les cellules, ce qui est connu pour améliorer la différenciation²⁴. L’effet net est la génération de messagers secondaires qui stimulent la transcription des facteurs déclenchant les processus cellulaires en aval tels que la migration, la prolifération et la différenciation²⁵. La PBM peut être utilisée pour préconditionner les cellules à proliférer ou à se différencier avant de les transplanter dans un environnement défavorable, par exemple dans un tissu endommagé²⁶. L’exposition aux PBM avant et après la greffe (630 nm et 810 nm) des ADSC a considérablement amélioré la viabilité et la fonction de ces cellules in vivo dans un modèle de rat diabétique²⁷. La médecine régénérative nécessite un nombre adéquat de cellules pour une réparation efficace des tissus²⁸. En culture cellulaire 3D, les ADSC ont été associés à des taux de prolifération plus lents par rapport à la culture cellulaire bidimensionnelle⁶. Cependant, la PBM peut être utilisée pour augmenter le processus de culture cellulaire 3D des ADSC en améliorant la viabilité, la prolifération, la migration et la différenciation^29,30.

Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et logiciels utilisés dans ce protocole. Le protocole a été résumé graphiquement dans la figure 1. 1. Culture cellulaire bidimensionnelle (2D) REMARQUE : Les ADSC immortalisés (1 x106 cellules) sont conservés à -195,8 °C dans de l’azote liquide dans un flacon de cryoconservation contena…

Representative Results

Pour évaluer la morphologie et inspecter visuellement la densité cellulaire des hydrogels, la microscopie inverse a été utilisée (Figure 2). Les ADSC ont conservé une morphologie arrondie 24 h après l’ensemencement et l’exposition au PBM. Les cellules étaient dispersées dans le gel sous forme de cellules uniques ou en grappes ressemblant à des raisins. La morphologie était inchangée après 10 jours en culture 3D. Aucune différence morphologique définitive n’a été notée…

Discussion

Les ADSC sont un type de cellule idéal à utiliser pour la médecine régénérative car ils stimulent divers processus pour aider à la cicatrisation des plaies ^3,4. Cependant, plusieurs défis doivent être contournés, par exemple, de faibles taux de survie et une greffe inefficace des cellules dans un site de lésion⁹. Les cellules immortalisées ont été utilisées comme lignée cellulaire disponible dans le commerce, car elles peuv…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader