광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양
Summary
여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
줄기세포와 유사한 다능성 중간엽 특성을 가진 지방 유래 줄기세포(ADSC)는 다양한 세포 분화 능력과 이동, 증식 및 염증 완화 능력으로 인해 재생 의학에 자주 사용됩니다. 그러나 ADSC는 주로 불리한 염증 조건으로 인해 생존 및 상처 내 생착에 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 하이드로겔은 상처에서 ADSC 생존력을 유지하고 상처 치유 과정을 촉진하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 3D 세포 배양 프레임워크 내에서 ADSC 증식 및 세포 독성에 대한 광생물 조절(PBM)의 시너지 효과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 불멸화된 ADSC를 2.5 x 103 세포 밀도의 10μL 하이드로겔에 파종하고 5J/cm2 및 10J/cm2의 유창성으로 525nm 및 825nm 다이오드를 사용하여 조사했습니다. 형태학적 변화, 세포독성 및 증식은 PBM 노출 후 24시간 및 10일에 평가되었습니다. ADSC는 둥근 형태를 나타내며 개별 세포 또는 스페로이드 응집체로 겔 전체에 분산되어 있습니다. 중요한 것은 PBM과 3D 배양 프레임워크 모두 세포에 대한 세포독성 효과가 없는 반면, PBM은 ADSC의 증식률을 크게 향상시켰다는 것입니다. 결론적으로, 이 연구는 ADSC 배양에 적합한 3D 환경으로 하이드로겔을 사용하는 것을 보여주고, 특히 3D 세포 배양과 관련된 느린 증식 속도를 해결하는 중요한 증식 전략으로 PBM을 소개합니다.
Introduction
ADSC는 자가 재생 및 여러 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가진 중간엽 다분화능 전구 세포입니다. 이들 세포는 지방 흡인 절차 중 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 채취할 수 있다1. ADSC는 줄기세포가 풍부하고, 채취가 최소한으로 침습적이며, 쉽게 접근할 수 있고, 특성이 우수하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 줄기세포 유형으로 부상하고있습니다 2. 줄기세포 치료는 세포 이동, 증식, 신생혈관 형성을 자극하고 상처 내 염증을 감소시킴으로써 상처 치유를 위한 가능한 방법을 제공한다 3,4. ADSC의 재생 능력의 약 80%는 분비체를 통한 파라크린 신호전달에 기인한다5. 이전에는, 줄기세포 또는 성장인자를 손상된 조직에 직접 국소적으로 주입하는 것이 충분한 생체 내 복구 메커니즘을 불법화할 수 있다고 제안되었다 6,7,8. 그러나 이 접근법은 염증 환경으로 인해 생존율이 낮고 손상된 조직 내에서 줄기세포 생착이 감소하는 등 몇 가지 문제에 직면했다 9. 더욱이, 인용된 이유 중 하나는 이식된 세포의 생존과 기능을 지원하는 세포외 기질의 부족이었다10. 이러한 문제를 극복하기 위해 줄기 세포의 생존력과 기능을 지원하는 생체 재료 운반체 개발에 중점을 두고 있습니다.
3차원(3D) 세포 배양은 in vitro에서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 향상시켜 in vivo 환경과 더 유사한 환경을 제공한다11. 하이드로겔은 줄기 세포 배양을 위한 3D 환경을 제공하는 생체 재료 운반체의 한 종류로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 이들 구조는 물과 가교결합된 중합체(12)로 이루어진다. 하이드로겔에 ADSC를 캡슐화하면 세포의 생존력을 유지하면서 배양 중 세포에 대한 세포독성 효과가 거의 없다6. 3D로 배양된 줄기세포는 줄기세포의 유지율이 향상되고 분화 능력이 향상됨을 입증한다13. 유사하게, 하이드로겔 시드 ADSC는 동물 모델에서 생존력 증가와 상처 봉합 가속화를 보여주었습니다14. 또한, 하이드로겔 캡슐화는 상처에서 ADSC의 생착 및 유지를 크게 증가시킨다15,16. TrueGel3D는 폴리비닐 알코올 또는 덱스트란과 같은 폴리머로 만들어지며, 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌 글리콜17과 같은 가교제에 의해 응고됩니다. 겔은 세포외 기질(18)을 효과적으로 모방하면서 겔을 환자에게 이식하는 동안 실험을 방해하거나 면역 반응을 유발할 수 있는 동물성 제품을 함유하지 않는 합성 하이드로겔이다. 젤은 구성과 개별 구성 요소를 변경하여 완전히 사용자 정의할 수 있습니다. 그것은 상이한 줄기세포를 수용할 수 있고, 겔(19)의 강성을 조절함으로써 여러 세포 유형의 분화를 지원할 수 있다. 부착 부위는 펩티드20의 첨가를 통해 생성될 수 있다. 겔은 메탈로프로테아제의 분비에 의해 분해될 수 있으며, 세포 이동을 허용한다21. 마지막으로, 명확하고 이미징 기술을 허용합니다.
PBM은 세포 내 발색단을 자극하는 데 사용되는 최소 침습적이고 쉽게 수행할 수 있는 저수준 레이저 치료법입니다. 서로 다른 파장은 세포에 서로 다른 영향을 미친다22. 적색에서 근적외선 범위의 빛은 전자 수송 사슬(23)을 통한 플럭스를 강화하여 증가된 아데노신 삼인산(ATP) 및 활성 산소종(ROS) 생산을 자극합니다. 청색 및 녹색 범위의 빛은 광 개폐 이온 채널을 자극하여 칼슘 및 마그네슘과 같은 양이온이 세포로 비특이적으로 유입되도록 하며, 이는 분화를 향상시키는 것으로 알려져 있습니다24. 최종 효과는 이동, 증식, 분화와 같은 다운스트림 세포 과정을 유발하는 인자의 전사를 자극하는 2차 메신저의 생성이다25. PBM은 세포를 불리한 환경, 예를 들어, 손상된 조직(26)에 이식하기 전에 증식 또는 분화하기 위해 세포를 전처리하는데 사용될 수 있다. ADSC의 이식 전 및 이식 후 PBM(630nm 및 810nm) 노출은 당뇨병 쥐 모델27에서 이들 세포의 생체 내 생존력과 기능을 유의하게 향상시켰다. 재생의학은 조직의 효과적인 복구를 위해 적절한 수의 세포를 필요로 한다28. 3D 세포 배양에서 ADSC는 2차원 세포 배양에 비해 느린 증식 속도와 관련이 있습니다6. 그러나 PBM은 생존력, 증식, 이동 및 분화를 향상시켜 ADSC의 3D 세포 배양 공정을 강화하는 데 사용할 수 있습니다29,30.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC는 상처 치유를 돕기 위해 다양한 과정을 자극하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 세포 유형입니다 3,4. 그러나, 예를 들어, 낮은 생존율과 손상 부위에 세포의 비효율적인 생착과 같은 몇 가지 문제를 피해야 한다9. 불멸화된 세포는 일차 세포에 비해 더 많은 세대에 걸쳐 전달될 수 있고, 수확할 필요가 없으며, 특성화가 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 남아프리카 공화국 국립 연구 재단 (National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, 보조금 번호 TTK2205035996; 과학혁신부(DSI)는 아프리카 레이저 센터(ALC)에 자금을 지원했으며, ALC-R007 과제HLHA23X 부여 번호; 대학 연구 위원회, 보조금 번호 2022URC00513; 과학기술부(Department of Science and Technology)의 남아프리카 연구 의장 이니셔티브(DST-NRF/SARChI), 보조금 번호 98337. 연구비 지원 기관은 연구의 설계, 수집, 분석, 데이터 해석 또는 원고 작성에 아무런 역할도 하지 않았다. 저자들은 요하네스버그 대학교(UJ)와 레이저 연구 센터(LRC)의 시설 및 자원 사용에 대해 감사를 표합니다.
Materials
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
