Tredimensjonal cellekultur av fettavledede stamceller i en hydrogel med fotobiomoduleringsforstørrelse

Summary

Her presenterer vi en protokoll som demonstrerer bruken av hydrogel som et tredimensjonalt (3D) cellekulturrammeverk for adipose-avledet stamcellekultur (ADSC) og introduserer fotobiomodulering (PBM) for å forbedre spredning av ADSC innenfor 3D-kulturinnstillingen.

Abstract

Adipose-avledede stamceller (ADSC), som har multipotente mesenkymale egenskaper som ligner på stamceller, brukes ofte i regenerativ medisin på grunn av deres evne til et mangfoldig utvalg av celledifferensiering og deres evne til å forbedre migrasjon, spredning og redusere betennelse. Imidlertid står ADSC ofte overfor utfordringer i overlevelse og transplantasjon i sår, hovedsakelig på grunn av ugunstige inflammatoriske tilstander. For å løse dette problemet har hydrogeler blitt utviklet for å opprettholde ADSC-levedyktighet i sår og fremskynde sårhelingsprosessen. Her hadde vi som mål å vurdere den synergistiske effekten av fotobiomodulering (PBM) på ADSC-proliferasjon og cytotoksisitet innenfor et 3D-cellekulturrammeverk. Immortaliserte ADSCer ble sådd i 10 μL hydrogeler med en tetthet på 2,5 x 10³ celler og utsatt for bestråling ved bruk av 525 nm og 825 nm dioder ved fluenser på 5 J / cm² og 10 J / cm². Morfologiske endringer, cytotoksisitet og proliferasjon ble evaluert 24 timer og 10 dager etter PBM-eksponering. ADSC-ene viste en avrundet morfologi og ble dispergert gjennom gelen som individuelle celler eller sfæroidaggregater. Det er viktig at både PBM og 3D-kulturrammeverket ikke viste noen cytotoksiske effekter på cellene, mens PBM signifikant forbedret proliferasjonshastighetene til ADSCs. Avslutningsvis demonstrerer denne studien bruken av hydrogel som et egnet 3D-miljø for ADSC-kultur og introduserer PBM som en betydelig forsterkningsstrategi, spesielt med tanke på de langsomme proliferasjonshastighetene forbundet med 3D-cellekultur.

Introduction

ADSC er mesenkymale multipotente stamceller med kapasitet til selvfornyelse og differensiering i flere cellelinjer. Disse cellene kan høstes fra den stromale vaskulære fraksjonen (SVF) av fettvev under en lipoaspirasjonsprosedyre¹. ADSC har dukket opp som en ideell stamcelletype til bruk i regenerativ medisin fordi disse cellene er rikelig, minimalt invasive for høsting, lett tilgjengelige og godt karakteriserte². Stamcelleterapi tilbyr en mulig vei for sårheling ved å stimulere cellemigrasjon, spredning, neovaskularisering og redusere betennelse i sår ^3,4. Omtrent 80% av den regenerative kapasiteten til ADSC kan tilskrives parakrin signalering via deres sekrin⁵. Tidligere ble det foreslått at en direkte lokal injeksjon av stamceller eller vekstfaktorer i skadet vev kunne ulovlig tilstrekkelig in vivo reparasjonsmekanismer ^6,7,8. Imidlertid møtte denne tilnærmingen flere utfordringer, for eksempel dårlig overlevelse og redusert stamcelletransplantasjon i skadet vev som følge av det inflammatoriske miljøet ⁹. Videre var en av grunnene som ble nevnt mangel på en ekstracellulær matrise for å støtte overlevelsen og funksjonaliteten til de transplanterte cellene¹⁰. For å overvinne disse utfordringene legges det nå vekt på utvikling av biomaterialbærere for å støtte stamcellenes levedyktighet og funksjon.

Tredimensjonal (3D) cellekultur forbedrer celle-til-celle- og celle-til-matrise-interaksjon in vitro for å gi et miljø som bedre ligner in vivo-miljøet ¹¹. Hydrogeler har blitt grundig studert som en klasse av biomaterialbærere som gir et 3D-miljø for stamcellekultur. Disse strukturene er laget av vann og tverrbundne polymerer¹². Innkapsling av ADSC i hydrogel har praktisk talt ingen cytotoksisk effekt på cellene under kultur, samtidig som cellens levedyktighet^{opprettholdes 6}. Stamceller dyrket i 3D demonstrerer forbedret oppbevaring av stammen og forbedret differensieringskapasitet¹³. På samme måte viste hydrogelfrøede ADSC-er økt levedyktighet og akselerert sårlukking i dyremodeller¹⁴. Videre øker hydrogelinnkapsling signifikant engraftment og oppbevaring av ADSC i sår^15,16. TrueGel3D er laget av en polymer, enten polyvinylalkohol eller dextran, størknet av en tverrbinder, enten cyklodekstrin eller polyetylenglykol¹⁷. Gelen er en syntetisk hydrogel som ikke inneholder noen animalske produkter som kan forstyrre forsøkene eller utløse en immunreaksjon under transplantasjonen av gelen til en pasient mens den effektivt etterligner en ekstracellulær matrise¹⁸. Gelen er fullt tilpassbar ved å endre sammensetningen og individuelle komponenter. Den kan huse forskjellige stamceller og støtte differensiering av flere celletyper ved å justere stivheten til gelen¹⁹. Festesteder kan opprettes ved tilsetning av peptider²⁰. Gelen er nedbrytbar ved utskillelse av metalloproteases, noe som muliggjør cellemigrasjon²¹. Til slutt er det klart og gir mulighet for avbildningsteknikker.

PBM er en minimalt invasiv og lett utført form for lavnivå laserterapi som brukes til å stimulere intracellulære kromoforer. Ulike bølgelengder fremkaller forskjellige effekter på celler²². Lys i det røde til nær-infrarøde området stimulerer økt adenosintrifosfat (ATP) og reaktiv oksygenproduksjon (ROS) ved å øke fluksen gjennom elektrontransportkjeden²³. Lys i de blå og grønne områdene stimulerer lysstyrte ionkanaler, noe som muliggjør den ikke-spesifikke tilstrømningen av kationer, som kalsium og magnesium, til celler, som er kjent for å forbedre differensiering²⁴. Nettoeffekten er genereringen av sekundære budbringere som stimulerer transkripsjonen av faktorer som utløser nedstrøms cellulære prosesser som migrasjon, spredning og differensiering²⁵. PBM kan brukes til å prekondisjonere celler til å proliferere eller differensiere før transplantasjon av cellene til et ugunstig miljø, for eksempel skadet vev²⁶. PBM før og etter transplantasjon (630 nm og 810 nm) eksponering av ADSC forbedret levedyktigheten og funksjonen til disse cellene in vivo betydelig i en diabetisk rottemodell²⁷. Regenerativ medisin krever et tilstrekkelig antall celler for effektiv reparasjon av vev²⁸. I 3D-cellekultur har ADSC vært assosiert med langsommere proliferasjonshastigheter sammenlignet med todimensjonal cellekultur⁶. PBM kan imidlertid brukes til å øke 3D-cellekulturprosessen til ADSC ved å øke levedyktigheten, spredning, migrasjon og differensiering^29,30.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og programvare som brukes i denne protokollen. Protokollen er grafisk oppsummert i figur 1. 1. Todimensjonal (2D) cellekultur MERK: Immortaliserte ADSC (1 x106 celler) lagres ved -195,8 °C i flytende nitrogen i et kryopreserveringshetteglass som inneholder 1 ml cellefrysemedier. Klargjøre 2D-cellegj…

Representative Results

For å vurdere morfologien og visuelt undersøke hydrogelenes celletetthet ble det brukt invers mikroskopi (figur 2). ADSC-ene beholdt en avrundet morfologi 24 timer etter såing og PBM-eksponering. Cellene ble spredt gjennom gelen som enkeltceller eller i druelignende klynger. Morfologien var uendret etter 10 dager i 3D-kultur. Ingen definitiv forskjell i morfologi ble notert mellom eksperimentgruppene og kontrollgruppene eller mellom de forskjellige eksperimentelle gruppene. <p class="…

Discussion

ADSC er en ideell celletype å bruke til regenerativ medisin, da de stimulerer ulike prosesser for å hjelpe til med sårheling ^3,4. Det er imidlertid flere utfordringer som må omgås, for eksempel dårlig overlevelse og ineffektiv inntransplantasjon av cellene i et skadested⁹. Immortaliserte celler ble brukt som en kommersielt tilgjengelig cellelinje, da de kan passeres i flere generasjoner sammenlignet med primære celler, de trenger ik…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader