Cultura Celular Tridimensional de Células-Tronco Derivadas do Tecido Adiposo em Hidrogel com Aumento da Fotobiomodulação

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando o uso de hidrogel como uma estrutura de cultura de células tridimensional (3D) para cultura de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) e introduzindo fotobiomodulação (PBM) para aumentar a proliferação de ADSCs dentro do ambiente de cultura 3D.

Resumo

Células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs), possuindo características mesenquimais multipotentes semelhantes às células-tronco, são frequentemente empregadas na medicina regenerativa devido à sua capacidade de diferenciação celular diversificada e sua capacidade de aumentar a migração, proliferação e mitigar a inflamação. No entanto, as ADSCs frequentemente enfrentam desafios na sobrevida e enxertia dentro de feridas, principalmente devido a condições inflamatórias desfavoráveis. Para resolver essa questão, hidrogéis foram desenvolvidos para sustentar a viabilidade de ADSC em feridas e agilizar o processo de cicatrização de feridas. Aqui, nosso objetivo foi avaliar o impacto sinérgico da fotobiomodulação (PBM) na proliferação e citotoxicidade de ADSC dentro de uma estrutura de cultura celular 3D. ADSCs imortalizadas foram semeadas em hidrogéis de 10 μL a uma densidade de 2,5 x 10³ células e submetidas à irradiação usando diodos de 525 nm e 825 nm nas fluências de 5 J/cm² e 10 J/cm². Alterações morfológicas, citotoxicidade e proliferação foram avaliadas 24 h e 10 dias após a exposição ao PBM. As ADSCs exibiram uma morfologia arredondada e foram dispersas por todo o gel como células individuais ou agregados esferoides. É importante ressaltar que tanto o PBM quanto a estrutura de cultura 3D não apresentaram efeitos citotóxicos sobre as células, enquanto o PBM aumentou significativamente as taxas de proliferação de ADSCs. Em conclusão, este estudo demonstra o uso de hidrogel como um ambiente 3D adequado para cultura de ADSC e introduz o PBM como uma estratégia de aumento significativo, particularmente abordando as taxas de proliferação lentas associadas à cultura de células 3D.

Introdução

As ADSCs são células progenitoras mesenquimais multipotentes com capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em várias linhagens celulares. Essas células podem ser retiradas da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo durante um procedimento de^{lipoaspiração1}. As ADSCs têm emergido como um tipo ideal de células-tronco para uso em medicina regenerativa, pois são abundantes, minimamente invasivas para a colheita, de fácil acesso e bem^{caracterizadas2}. A terapia com células-tronco oferece um caminho possível para a cicatrização de feridas, estimulando a migração celular, a proliferação, a neovascularização e reduzi....

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo. O protocolo foi resumido graficamente na Figura 1.

1. Cultura celular bidimensional (2D)

NOTA: Os ADSCs imortalizados (1 x10⁶ células) são armazenados a -195,8 °C em azoto líquido num frasco para injetáveis de criopreservação contendo 1 ml de meio de congelação celular.

1. Preparação do meio de recuperação celular 2D e do frasco de cultura 2D
   1. Transferir 39 mL do meio basal para um tubo centr....

Resultados

Para avaliar a morfologia e inspecionar visualmente a densidade celular dos hidrogéis, foi utilizada microscopia inversa (Figura 2). As ADSCs mantiveram uma morfologia arredondada 24 h após a semeadura e exposição ao PBM. As células foram espalhadas por todo o gel como células únicas ou em cachos semelhantes a uvas. A morfologia manteve-se inalterada após 10 dias em cultura 3D. Nenhuma diferença definitiva na morfologia foi observada entre os grupos experimentais e controles ou entre os dife.......

Discussão

As ADSCs são um tipo celular ideal para uso em medicina regenerativa, pois estimulam vários processos para auxiliar na cicatrização de feridas ^3,4. No entanto, há vários desafios que precisam ser contornados, por exemplo, baixas taxas de sobrevida e enxertia ineficaz das células em um local de^lesão9. As células imortalizadas foram utilizadas como linhagem celular comercialmente disponível, pois podem ser passadas por mais gerações em relaç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laser de diodo de 525 nm	Centro Nacional de Laser da África do Sul	EN 60825-1:2007
Laser de diodo de 825 nm	Centro Nacional de Laser da África do Sul	SN 101080908ADR-1800
96 Placas de tira de poço	Sigma-Aldrich	BR782301
Anfotericina B	Antibiótico Sigma-Aldrich	A2942	(0,5%; 0,5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viabilidade Ensaio	Promega	G9681	Reagente ATP, Kit de ensaio de proliferação
Corning 2 mL Frasco criogênico de polipropileno com rosca externa	Corning	430659	criovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Meios de congelamento de células
CytoTox96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa	Promega	G1780	Reagente de citotoxicidade
Dulbecco' s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
Medidor de potência a laser	FieldMate Coerente	1098297
de poliestireno transparente Corning 96 poços de fundo plano	Sigma-Aldrich	CLS3370
Soro bovino fetal	Biochrom	S0615	Enriquecimento do meio de cultura (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Solução salina balanceada Hanks (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Solução de enxágue
Heracell 150i Incubadora de CO2	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Girador de placas para placas de 96 poços
Centrífuga Heraeus Megafuge 16R	ThermoFisher	75004270
ADSCs imortalizados	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passagem 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Contador de células automatizado para banho-maria Trypan Blue
Julabo TW20	Sigma-Aldrich	Z615501	Banho-maria usado para aquecer mídia a 37 &graus; C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Versão 3.2 (23706)	Software de imagem: aquisição de imagem digital
luz invertida	Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019
Câmera Olympus SC30	Câmera	Olympus SN57000530	acoplada ao microscópio de luz invertida
Microplacas de poliestireno sólido Corning 96 de paredes opacas	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaco bem usado para luminescência ATP
Penicilina-Estreptomicina	Antibiótico Sigma-Aldrich	P4333	(0,5%; 0,5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporado
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µ L
TrueGel3D Solução de Recuperação de Células Enzimáticas	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	Solução de 0,4%
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Solução de desprendimento de células
Victor Nivo Leitor de placas	Perkin Elmer	HH3522019094	Leitor de placas espectrofotométricas

placa Microscópio de