Utvikling av en bio-hybrid mygg Stinger-basert atomkraftmikroskopisonde

Summary

Kvantitative og kontrollerte undersøkelser av insektbittatferd er avgjørende for å utarbeide effektive strategier for å bekjempe vektorbårne sykdommer. I denne sammenheng introduseres en metode for å fremstille en bio-hybrid atomkraftmikroskopi (AFM) sonde.

Abstract

Mygg, beryktet som de dødeligste dyrene til mennesker på grunn av deres evne til å overføre sykdommer, utgjør en vedvarende utfordring for folkehelsen. Den primære forebyggingsstrategien som for tiden er i bruk, involverer kjemiske repellenter, som ofte viser seg å være ineffektive ettersom mygg raskt utvikler motstand. Derfor er oppfinnelsen av nye forebyggende metoder avgjørende. Slik utvikling er avhengig av en grundig forståelse av myggbitingsadferd, noe som nødvendiggjør et eksperimentelt oppsett som nøyaktig replikerer faktiske bitescenarier med kontrollerbare testparametere og kvantitative målinger. For å bygge bro over dette gapet ble en bio-hybrid atomkraftmikroskopi (AFM) sonde konstruert, med en biologisk stinger – spesielt en mygglabrum – som spissen. Denne biohybridsonden, kompatibel med standard AFM-systemer, muliggjør en nesten autentisk simulering av myggpenetrasjonsadferd. Denne metoden markerer et skritt fremover i den kvantitative studien av bitemekanismer, som potensielt fører til etablering av effektive barrierer mot vektorbårne sykdommer (VBD) og åpner nye veier i kampen mot myggoverførbare sykdommer.

Introduction

Verdens helseorganisasjon (WHO) rapporterte at vektorbårne sykdommer (VBD) står for over 17% av alle smittsomme sykdommer, som forårsaker mer enn 7,00,000 dødsfall per år globalt. For eksempel, som det dødeligste dyret i verden, sprer mygg mange patogener, som dengue, malaria og Zika, gjennom blodfôrende leddyr, noe som resulterer i 700 millioner infeksjoner hvert år¹. Utforskning mot utvikling av effektive tiltak for å forhindre VBD er av avgjørende betydning, inkludert etterligning av myggens penetrasjonsadferd for å undersøke deres bitemekanismer og studier av potensielle barrierer for å bevise deres effektivitet for å forhindre penetrasjon. En sentral utfordring er å utvikle riktige tilnærminger for å utføre slike undersøkelser. Innsats har blitt gjort i litteraturen, inkludert utvikling av mikroskala nåler som ligner geometrien til en myggstikker; Imidlertid har mange av materialene som brukes til å lage disse mikronålene (dvs. viskoelastiske materialer², silisium (Si), glass, keramikk³, etc.) forskjellige mekaniske egenskaper enn det biologiske materialet i myggens proboscis. De konstruerte materialene kan være sprø og utsatt for brudd og knekking ^3,4, mens myggens snabel tåler brudd eller knekking bedre⁴. Fordelen med å ha en bio-hybrid sonde ved hjelp av labrum av en mygg i stedet for konstruerte materialer er at det kan være en mer nøyaktig representasjon av piercing mekanisme av mygg. Spesialverktøy må også integreres med mikronåler for å utføre kvantitative studier, for eksempel nøyaktig måling av kraft⁵, som ikke er lett oppnåelig med tilpassede oppsett ved bruk av konstruerte mikronåler.

Atomkraftmikroskopi (AFM) -basert tilnærming er lovende ved at den opererer ved å bruke en utkrager med en ultrafin spiss som er nøye plassert nær en prøves overflate. Spissen kan enten skanne over eller presses mot/inn i en overflate, og oppleve varierende attraktive eller frastøtende krefter på grunn av interaksjonen med en prøve⁶. Disse interaksjonene fører til utkragingens avbøyning, som spores av refleksjonen av en laserstråle fra utkragerens topp til en fotodetektor⁶. Den eksepsjonelle følsomheten for bevegelse av systemet gjør det mulig for AFM å gjennomføre et mangfoldig utvalg av målinger, inkludert, men ikke begrenset til, morfologisk kartlegging med pikometernøyaktighet, kraftmålinger som spenner fra piconewtons til micronewtons, og omfattende multifysikkundersøkelser⁷. For eksempel kan AFM-innrykk utføres for å nøyaktig vurdere responsen på den påførte kraften til en prøve og også for å måle hardheten, elastisiteten og andre mekaniske egenskaper til en prøve ved å koble til passende analytiske modeller⁸. Sonden til AFM er oftest laget av silisium (Si) eller silisiumnitrid (Si₃N₄) ⁸ med en lengde på 20-300 μm⁹ og en spissradius i størrelsesorden flere til titalls nanometer¹⁰. Nanometerskalaens spissradius kan være ideell for applikasjoner som høyoppløselig bildebehandling; Imidlertid har den ikke egenskapene til biologiske stingers for studier som prøver å etterligne penetrasjonsadferd når det gjelder stivhet, radius, form og størrelsesforhold. For eksempel er mikronedlstrukturen til en mygg fascicle, som har et sideforhold på ~ 60¹¹ (lengde ~ 1,5 mm til 2 mm; diameter ~ 30 μm) ¹². Mens en konvensjonell AFM-sonde kan antas å ligne en biologisk stinger som en labrum, vil dens distinkte materialegenskaper og dimensjoner ikke gjenspeile den virkelige situasjonen under et bitt.

For å muliggjøre kvantitative undersøkelser av penetrasjonsatferd som etterligner biologiske biter av insekter eller andre dyr med stingers, utvikles her en prosess for å fremstille bio-hybrid AFM-utkrager med en biologisk stinger når spissen er utviklet. Som en casestudie ble en AFM-utkrager med en mygglabrumspiss festet vellykket demonstrert. Ved å utnytte eksisterende informasjon fra litteratur om de typiske innsettingskreftene som en mygg bruker til å trenge gjennom offerets hud^12,13, kan denne bio-hybrid AFM-utkragingen potensielt tillate nesten ekte etterligning av myggbitt under en vanlig AFM. Protokollen for å utnytte mikrobiologiske brodder for å fremstille bio-hybrid AFM-utkragere kan også brukes til utvikling av andre skarpe stingerbaserte biohybrid AFM-utkrager for kvantitative undersøkelser av en rekke bitemekanismer.

Terminologier
Et skjema av en snabel og dens komponenter av interesse er vist i figur 1, og deres definisjoner er (1) Snabel: en kroppsdel fra munnen av en mygg som gjør at mygg å mate seg selv, med en kjerne-skall struktur sammensatt av fascicle (kjerne) og labium (skall), (2) Labium: den mørke og stumpe ytre dekselet på en snabel², (3) Fascicle: en gruppe slanke nåler inneholdt inne i labium, inkludert to maxillae, to mandibler, en hypopharynx og en labrum², (4) Hypopharynx: ansvarlig for å utskille spytt i vertens blodstrøm², (5) Maxillae: taggete medlem som hjelper til med fôringsmekanismen², (5) Mandibler: ligner maxillaen, de hjelper myggen i fôringsmekanismen og har en skarp spiss², (6) Labrum: hovedmedlemmet for å trenge inn i huden til et offer, som er mye større enn maxillae, mandibler og hypopharynx. Den har også sensoriske strukturer som gjør det mulig å finne blodkar og indre kanaler under huden², (7) Manipulator: en samling med tre frihetsgrader og mikronskala nøyaktighet for posisjonering, slik at bevegelse i XYZ-retninger, (8) Klemmemontering: en skreddersydd 2-delt klemme montert på manipulatoren som brukes til å klemme den spissløse AFM-utkrageren under eksperimentet.

Protocol

Myggarten som brukes til denne protokollen er en uinfisert voksen hunn Aedes aegypti (A. aegypti), mottatt frosset og lagret i en fryser på -20 °C. Arten ble levert av NIH / NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center for distribusjon gjennom BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Reagensene og utstyret som brukes til studien er oppført i materialfortegnelsen. 1. Dissekere la…

Representative Results

Skanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av den fabrikkerte bio-hybrid AFM-sonden finnes i figur 7. Enden av labrum ble vellykket limt til den tipless cantilever bjelken. På grunn av den naturlige krumningen av myggstikkere og den manuelle driften av den presenterte protokollen, er det ekstremt vanskelig å skaffe en cantilever med en stingerspiss perfekt vinkelrett på utkrageren. Off-center vinkelen mellom stinger og en imaginær senterlinje vinkelrett på utkrageren er vanligvis ~ 10 gra…

Discussion

Trinn 1 i protokollen er ment å rense den biologiske prøven av det uønskede kjønnsleppene. For å oppnå dette gjøres det et snitt på labium, men ikke på fascikelen, som hviler rett under labium (figur 1). Fordi fascicle og labium ikke er sammenføyd ved deres grensesnitt (dvs. labium er fri til å gli langs fascicle og holdes bare på plass ved sitt vedlegg til mygghodet), er det utførte snittet ment å skille en del av labium fra myggens hode, og dermed lette fjerning av ytre dekse…

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Largura: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.