Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Resumo

O baço é um órgão imunológico que desempenha um papel fundamental nas respostas imunes transmitidas pelo sangue. A perda anatômica ou funcional desse tecido aumenta a suscetibilidade a infecções sanguíneas graves e sepse. O autotransplante de cortes de baço tem sido usado clinicamente para repor o tecido perdido e restaurar a função imunológica. No entanto, o mecanismo que conduz a regeneração robusta e imunologicamente funcional do tecido baço ainda não foi totalmente elucidado. Aqui, pretendemos desenvolver um método para agregar e encapsular células do baço dentro de uma matriz semissólida, a fim de investigar as necessidades celulares para a formação de tecido esplênico. Construções celulares encapsuladas em matriz de membrana basal são passíveis tanto de cultura in vitro de organoides tridimensionais quanto de transplante sob a cápsula renal para avaliar diretamente a formação de tecidos in vivo . Através da manipulação das células de entrada para agregação e encapsulamento, demonstramos que as células estromais neonatais PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- derivadas do enxerto são necessárias para a regeneração do tecido esplênico em modelos de transplante animal.

Introdução

A ruptura traumática do baço e o aparecimento de múltiplos nódulos esplênicos no corpo foi um dos primeiros indícios de que o tecido esplênico abrigava capacidade regenerativa ^1,2. Os autotransplantes de baço foram posteriormente introduzidos na clínica para preservar o tecido esplênico em pacientes que necessitaram de esplenectomia de emergência³. No entanto, apesar de fazer parte da prática clínica há décadas, muito pouco se sabe sobre como o baço se regenera. Modelos de transplante animal têm fornecido informações sobre múltiplos parâmetros da regeneração do baço e da função imune

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQBR/079/19).

1. Coleta de tecidos e preparo de células estromais

1. Eutanásia de camundongos doadores neonatais BALB/c machos e/ou fêmeas de 0,5-1,5 dias de idade por indução de hipotermia, envolvendo os animais dentro do papel higiênico e colocando-os sob gelo triturado por >10 min.
   NOTA: Este protocolo pode ser adaptado a diferentes linhagens de camundongos, idades e número de animais.
2. Preparar instrumentos cirúrgicos estéreis.
3. Coloqu....

Resultados

A agregação celular é importante para promover o contato e a sinalização célula-a-célula. Os agregados celulares que envolvem o interior da matriz da membrana basal suportaram ambas as culturas tridimensionais para a formação de organoides teciduais in vitro e facilitaram a entrega mecânica das células na cápsula renal para o transplante do enxerto. Para estabelecer esses construtos, a matriz da membrana basal foi primeiramente mantida em estado fluídico sob condições geladas. A agregação celular foi subsequente.......

Discussão

A agregação de células neonatais do baço dentro de um meio semissólido representa um método viável para a geração de construtos esplênicos. Protocolos semelhantes baseados em matriz de membrana basal têm sido utilizados para iniciar culturas tridimensionais do baço¹⁰. Aqui, demonstramos que construtos esplênicos são igualmente passíveis de sistemas de cultura de organoides in vitro , bem como de modelos de transplante in vivo . É importante ressaltar que o transplante de organoid.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
96 Tubos de Cluster de Polipropileno de 1,2 mL	Corning	CLS4401	Para colocar dentro de um tubo cônico de 14 ml
B-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use a 50 uM
Colagenase D	Roche	11088858001
Colagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	De Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I de pâncreas bovino, Tipo II-S, pó liofilizado, Proteína ≥ 80 %, ≥ 2.000 unidades/mg de proteína
Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg / L Glicose, L-Glutamina e Bicarbonato de Sódio, sem Piruvato de Sódio, Líquido. Estéril filtrado.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, filtrado estéril
Eclipse 200 μ l Pontas de Pipeta	Labcon	1030-260-000	Ponto de
Bisel Fetal Soro Bovino (FBS)	Gibco	26140-079	Lote# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Estoque 100X, use em 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel Matriz de base de membrana Alta Concentração, Lote# 7330186
MEM Aminoácidos Não essenciais	Gibco	11140076	Estoque 100X, use em 1X
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122	Estoque 10.000 unidades/ml Penicilina, 10.000 ug/ml
Filtro de Células Reversíveis	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Pinças de anel	NAPOX	A-26	Tamanho do anel: 3 mm
Inibidor de rocha (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		As velocidades de aceleração e desaceleração foram ajustadas para 8
pinças ultrafinas	EMS	78340-51S	Estilo 51S. As pinças de aço austenítico de baixo carbono SA antimagnéticas / antiácidas são resistentes à corrosão. Acabamento acetinado antirreflexo.
Vicryl 5/0 Sutura Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Êmbolo de Fio Longo	Drummond	5-000-2002-L	Êmbolo de Aço Inoxidável, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, Longo
Aplicador de Clipe de Ferida	MikRon	427630
Clips de Ferida	MikRon	427631	9 mm

Estreptomicina