Kældermembranmatrixindkapslet celleaggregering til undersøgelse af dannelse af murinmiltvæv

Summary

Denne artikel beskriver en protokol til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast kældermembranmatrix. Kældermembranmatrixkonstruktioner kan anvendes i tredimensionel kultur til undersøgelse af organoidudvikling eller til in vivo-transplantation og vævsregenereringsundersøgelser.

Abstract

Milten er et immunorgan, der spiller en central rolle i blodbårne immunresponser. Det anatomiske eller funktionelle tab af dette væv øger modtageligheden for alvorlige blodinfektioner og sepsis. Autotransplantation af miltskiver er blevet brugt klinisk til at erstatte tabt væv og genoprette immunfunktionen. Imidlertid er mekanismen, der driver robust og immunologisk funktionel miltvævsregenerering, ikke blevet fuldt belyst. Her sigter vi mod at udvikle en metode til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast matrix for at undersøge de cellulære behov for miltvævsdannelse. Kældermembranmatrixindkapslede cellekonstruktioner er modtagelige for både de vitro-vævskultur af tredimensionelle organoider såvel som transplantation under nyrekapslen for direkte at vurdere de vivo-vævsdannelse. Ved at manipulere inputcellerne til aggregering og indkapsling demonstrerer vi, at transplantatafledte PDGFRβ⁺MAdCAM-1^– neonatale stromale celler er nødvendige for miltvævsregenerering under dyretransplantationsmodeller.

Introduction

Traumatisk brud på milten og udseendet af flere miltknuder i kroppen var en af de første indikationer på, at miltvæv havde regenerativ kapacitet ^1,2. Miltautotransplantationer blev senere introduceret i klinikken for at bevare miltvæv hos patienter, der kræver akut splenektomi³. På trods af at det har været en del af klinisk praksis i årtier, er der meget lidt kendt om, hvordan milten regenererer. Dyretransplantationsmodeller har givet indsigt i flere parametre for miltregenerering og immunfunktion ^4,5. Især har eksperimentelle modifikationer af transplantatpræparationsmetoden gjort det muligt at undersøge vævsregenerering mere detaljeret på cellulært og molekylært niveau.

Transplantationer, der involverer hele miltskiver, gennemgår en fase med massenekrose, før en ny miltstruktur genopbygges⁶. Den indledende fase af transplantannekrose tyder på, at hovedparten af transplanteret væv stort set består af røde og hvide blodlegemer og er unødvendig for miltregenerering. Dette blev undersøgt eksperimentelt ved at udelukke hæmatopoietiske celler fra milttransplantater før transplantation under musens nyrekapsel. Her viste miltens ikke-leukocyt/ikke-erytrocytfraktion, som omfatter stromale og endotelceller, sig at være tilstrækkelig til at inducere de novo vævsdannelse⁷. Miltstromalvæv kunne yderligere behandles til en enkeltcellesuspension, hvilket muliggør anvendelse af cellesorteringsteknologier til at manipulere cellulær transplantatsammensætning. Ved selektivt at fjerne kandidatcelletyper blev der identificeret to CD45-TER-119-stromale cellepopulationer, der var uundværlige for transplantatudvikling: en endotellignende CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ cellepopulation og en mere bredt defineret PDGFRβ⁺ mesenkymalcellepopulation⁸.

Konstruktionen af transplantater fra miltceller varierer med hensyn til støttematerialer og cellebelastningsprocesser. Milt fremstillet ud fra manipuleret væv er tidligere blevet fremstillet ved at lægge miltenheder på et polyglykolsyre/poly-L mælkesyrepolymerstillads ^5,9. Interessant nok kunne miltstromale celler absorberet i en kollagensvamp ikke indpodes, mens stromale celler aggregeret og indlæst over et kollagenark lettede miltregenerering⁸. Resuspensionen af miltstromale celler inde i en Matrigel-matrix har også vist sig at inducere celleaggregering under tredimensionelle kulturbetingelser¹⁰. Denne metode er dog ikke testet til brug i transplantationsmodeller. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at tvangsaggregere og indkapsle miltstromale celler direkte i kældermembranmatrixen, som efterfølgende kan overføres til et tredimensionelt de vitro-vævskultursystem eller anvendes som et køretøj til dyremodeltransplantationer (supplerende figur 1).

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til forsøgsprotokoller godkendt af University of Queensland Animal Ethics Committee (UQBR/079/19). 1. Vævsopsamling og stromalcelleforberedelse Aflive 0,5-1,5 dage gamle han- og/eller hun-BALB/c neonatale donormus ved induktion af hypotermi ved at pakke dyrene ind i silkepapiret og lægge dem under knust is i >10 min.BEMÆRK: Denne protokol kan tilpasses forskellige musestammer, aldre og antallet af dyr. Forbere…

Representative Results

Celleaggregering er vigtig for at fremme celle-til-celle-kontakt og signalering. Indkapsling af celleaggregater inde i kældermembranmatrixen understøttede begge 3-dimensionelle kulturer til in vitro vævsorganoiddannelse og lettede den mekaniske levering af celler i nyrekapslen til transplantattransplantation. For at etablere disse konstruktioner blev kældermembranmatrixen først opretholdt i flydende tilstand under iskolde forhold. Celleaggregering blev efterfølgende opnået ved lagdeling af en koncentreret…

Discussion

Aggregeringen af neonatale miltceller inde i et halvfast medium repræsenterer en levedygtig metode til generering af miltkonstruktioner. Lignende kældermembranmatrixbaserede protokoller er blevet brugt til at initiere tredimensionelle miltkulturer¹⁰. Her demonstrerer vi, at miltkonstruktioner er lige så modtagelige for in vitro organoidkultursystemer såvel som in vivo-transplantationsmodeller . Det skal bemærkes, at transplantationen af in vitro-dyrkede miltorganoid…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm