तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स Encapsulated सेल एकत्रीकरण Murine तिल्ली ऊतक गठन की जांच के लिए
Summary
यह आलेख एकत्रीकरण और एक अर्द्ध ठोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर तिल्ली कोशिकाओं encapsulating के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स निर्माणों का उपयोग तीन आयामी संस्कृति में ऑर्गेनॉइड विकास का अध्ययन करने के लिए, या विवो प्रत्यारोपण और ऊतक पुनर्जनन अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
Abstract
प्लीहा एक प्रतिरक्षा अंग है जो रक्त-जनित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस ऊतक के शारीरिक या कार्यात्मक नुकसान से गंभीर रक्त संक्रमण और सेप्सिस की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। प्लीहा स्लाइस के ऑटो-प्रत्यारोपण का उपयोग चिकित्सकीय रूप से खोए हुए ऊतक को बदलने और प्रतिरक्षा समारोह को बहाल करने के लिए किया गया है। हालांकि, मजबूत और प्रतिरक्षात्मक रूप से कार्यात्मक प्लीहा ऊतक पुनर्जनन ड्राइविंग तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। यहां, हम तिल्ली ऊतक गठन के लिए सेलुलर आवश्यकताओं की जांच करने के लिए एक अर्ध-ठोस मैट्रिक्स के भीतर प्लीहा कोशिकाओं को एकत्रित करने और एनकैप्सुलेट करने के लिए एक विधि विकसित करना चाहते हैं। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स encapsulated सेल constructs दोनों तीन आयामी organoids के इन विट्रो ऊतक संस्कृति के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण सीधे विवो ऊतक गठन में आकलन करने के लिए उत्तरदायी हैं. एकत्रीकरण और एनकैप्सुलेशन के लिए इनपुट कोशिकाओं में हेरफेर करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि पशु प्रत्यारोपण मॉडल के तहत प्लीहा ऊतक पुनर्जनन के लिए ग्राफ्ट-व्युत्पन्न PDGFRβ + MAdCAM-1– नवजात स्ट्रोमल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
Introduction
प्लीहा के दर्दनाक टूटना और शरीर में कई प्लीहा पिंड की उपस्थिति पहले संकेत है कि तिल्ली ऊतक पुनर्योजी क्षमता 1,2 परेशान में से एक था. तिल्ली ऑटो-प्रत्यारोपण को बाद में क्लिनिक में पेश किया गया था ताकि आपातकालीन स्प्लेनेक्टोमी3 की आवश्यकता वाले रोगियों में प्लीहा ऊतक को संरक्षित किया जा सके। फिर भी, दशकों से नैदानिक अभ्यास का हिस्सा होने के बावजूद, बहुत कम लोग इस बारे में जानते हैं कि प्लीहा कैसे पुनर्जीवित होता है। पशु प्रत्यारोपण मॉडल तिल्ली पुनर्जनन और प्रतिरक्षा समारोह 4,5 के कई मापदंडों में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. विशेष रूप से, ग्राफ्ट तैयारी विधि के लिए प्रयोगात्मक संशोधनों ऊतक पुनर्जनन सेलुलर और आणविक स्तर पर अधिक से अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा करने की अनुमति दी है.
पूरे प्लीहा स्लाइस शामिल प्रत्यारोपण बड़े पैमाने पर परिगलन के एक चरण से गुजरना इससे पहले कि एक नई तिल्ली संरचनापुनर्निर्माण किया जाता है 6. ग्राफ्ट नेक्रोसिस के प्रारंभिक चरण से पता चलता है कि प्रत्यारोपित ऊतक के थोक में बड़े पैमाने पर लाल और सफेद रक्त कोशिकाएं होती हैं और प्लीहा पुनर्जनन के लिए अनावश्यक होती हैं। माउस किडनी कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण से पहले प्लीहा ग्राफ्ट से हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को बाहर करके प्रयोगात्मक रूप से इसकी जांच की गई थी। यहां, प्लीहा के गैर-ल्यूकोसाइट / गैर-एरिथ्रोसाइट अंश, जिसमें स्ट्रोमल और एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं, को डी नोवो ऊतक गठन7 को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त दिखाया गया था। प्लीहा स्ट्रोमल ऊतक को आगे एकल-कोशिका निलंबन में संसाधित किया जा सकता है, जिससे सेलुलर ग्राफ्ट संरचना में हेरफेर करने के लिए सेल सॉर्टिंग तकनीकों का उपयोग सक्षम हो सकता है। चुनिंदा उम्मीदवार सेल प्रकारों को हटाकर, दो सीडी 45-टीईआर -119– स्ट्रोमल सेल आबादी की पहचान की गई जो भ्रष्टाचार विकास के लिए अपरिहार्य थे: एक एंडोथेलियल जैसी सीडी 31 + सीडी 105 + एमएडीसीएएम -1 + सेल आबादी और अधिक व्यापक रूप से परिभाषित पीडीजीएफआर + मेसेनकाइमल सेल आबादी8।
प्लीहा कोशिकाओं से ग्राफ्ट का निर्माण समर्थन सामग्री और सेल-लोडिंग प्रक्रियाओं के संदर्भ में भिन्न होता है। ऊतक-इंजीनियर प्लीहा पहले एक पॉलीग्लाइकोलिक एसिड/पॉली-एल लैक्टिक एसिड बहुलक मचान 5,9 पर प्लीहा इकाइयों को लोड करके तैयार किया गया है। दिलचस्प है, एक कोलेजन स्पंज में अवशोषित प्लीहा स्ट्रोमल कोशिकाओं उत्कीर्ण करने में विफल रहा, जबकि स्ट्रोमल कोशिकाओं एकत्रित और एक कोलेजन शीट पर लोड 8 तिल्लीपुनर्जनन की सुविधा. एक Matrigel मैट्रिक्स के अंदर तिल्ली स्ट्रोमल कोशिकाओं के resuspension भी तीन आयामी संस्कृति शर्तों10 के तहत सेल एकत्रीकरण प्रेरित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, प्रत्यारोपण मॉडल में उपयोग के लिए इस पद्धति का परीक्षण नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य जबरन एकत्र करना और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर सीधे प्लीहा स्ट्रोमल कोशिकाओं को समाहित करना है, जिसे बाद में इन विट्रो टिशू कल्चर सिस्टम में त्रि-आयामी में स्थानांतरित किया जा सकता है या पशु मॉडल प्रत्यारोपण(पूरक चित्रा 1)के लिए एक वाहन के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक अर्ध-ठोस माध्यम के अंदर नवजात प्लीहा कोशिकाओं का एकत्रीकरण प्लीहा निर्माण उत्पन्न करने के लिए एक व्यवहार्य विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इसी तरह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स आधारित प्रोटोकॉल तीन आया?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल ऑफ ऑस्ट्रेलिया (#GNT1078247) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
Referências
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- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
