Basement Membrane Matrix Inkapslad cellaggregation för undersökning av vävnadsbildning i murina mjälte

Summary

Den här artikeln beskriver ett protokoll för att aggregera och kapsla in mjältceller i en halvfast basalmembranmatris. Basalmembranmatriskonstruktioner kan användas i tredimensionell odling för att studera organoidutveckling, eller för in vivo-transplantation och vävnadsregenereringsstudier.

Abstract

Mjälten är ett immunorgan som spelar en nyckelroll i blodburna immunsvar. Den anatomiska eller funktionella förlusten av denna vävnad ökar mottagligheten för allvarliga blodinfektioner och sepsis. Autotransplantation av mjältskivor har använts kliniskt för att ersätta förlorad vävnad och återställa immunfunktionen. Mekanismen som driver robust och immunologiskt funktionell mjältvävnadsregenerering har dock inte klarlagts helt. Här strävar vi efter att utveckla en metod för att aggregera och kapsla in mjältceller i en halvfast matris för att undersöka de cellulära kraven för mjältvävnadsbildning. Basalmembranmatrisinkapslade cellkonstruktioner är mottagliga för både de vitro-vävnadsodling av tredimensionella organoider samt transplantation under njurkapseln för att direkt bedöma vävnadsbildning in vivo. Genom att manipulera ingångscellerna för aggregering och inkapsling visar vi att transplantat-härledda PDGFRβ⁺MAdCAM-1-neonatala stromaceller krävs för regenerering av mjältvävnad under djurtransplantationsmodeller.

Introduction

Traumatisk bristning av mjälten och uppkomsten av flera mjältknölar i kroppen var en av de första indikationerna på att mjältvävnad hade regenerativ kapacitet ^1,2. Autotransplantationer av mjälte introducerades senare i kliniken för att bevara mjältvävnad hos patienter som behövde akut splenektomi³. Men trots att det har varit en del av klinisk praxis i årtionden är mycket lite känt om hur mjälten regenererar. Djurtransplantationsmodeller har gett insikt i flera parametrar för mjältregenerering och immunfunktion ^4,5. I synnerhet har experimentella modifieringar av graftberedningsmetoden gjort det möjligt att studera vävnadsregenerering mer i detalj på cellulär och molekylär nivå.

Transplantationer som involverar hela mjältskivor genomgår en fas av massnekros innan en ny mjältstruktur^{återuppbyggs}. Den inledande fasen av transplantatnekros tyder på att huvuddelen av transplanterad vävnad till stor del består av röda och vita blodkroppar och är onödig för mjältregenerering. Detta undersöktes experimentellt genom att utesluta hematopoetiska celler från mjälttransplantat före transplantation under musens njurkapsel. Här visade sig den icke-leukocyt/icke-erytrocytfraktionen i mjälten, som inkluderar stroma- och endotelceller, vara tillräcklig för att inducera de novo-vävnadsbildning ⁷. Mjältens stromavävnad kan bearbetas vidare till en encellssuspension, vilket möjliggör användning av cellsorteringsteknik för att manipulera cellulära transplantatkompositioner. Genom att selektivt ta bort kandidatcelltyper identifierades två CD45-TER-119-stromacellspopulationer som var oumbärliga för transplantatutveckling: en endotelliknande CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺-cellpopulation och en mer brett definierad PDGFRβ⁺ mesenkymal cellpopulation⁸.

Uppbyggnaden av transplantat från mjältceller varierar när det gäller stödmaterial och cellladdningsprocesser. Vävnadskonstruerad mjälte har tidigare framställts genom att ladda mjältenheter på en polyglykolsyra/poly-L mjölksyrapolymerställning ^5,9. Intressant nog misslyckades mjältens stromaceller absorberade i en kollagensvamp med att transplantera, medan stromaceller aggregerade och laddade över ett kollagenark underlättade mjältens regenerering⁸. Resuspensionen av mjältens stromaceller inuti en Matrigel-matris har också visat sig inducera cellaggregering under tredimensionella odlingsförhållanden¹⁰. Denna metod har dock inte testats för användning i transplantationsmodeller. Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att med tvång aggregera och kapsla in mjältstromaceller direkt i basalmembranmatrisen, som därefter kan överföras till ett tredimensionellt de vitro-vävnadsodlingssystem eller användas som ett fordon för djurmodelltransplantationer (tilläggsfigur 1).

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt experimentella protokoll som godkänts av University of Queensland Animal Ethics Committee (UQBR/079/19). 1. Vävnadsinsamling och stromacellsberedning Avliva 0,5-1,5 dagar gamla han- och/eller honmöss med BALB/c neonatal donator genom induktion av hypotermi genom att linda in djuren i silkespappret och placera dem under krossad is i >10 minuter.OBS: Detta protokoll kan anpassas till olika musstammar, åldrar och antalet djur.<…

Representative Results

Cellaggregering är viktigt för att främja cell-till-cell-kontakt och signalering. Inneslutning av cellaggregat inuti basalmembranmatrisen stödde båda 3-dimensionella kulturerna för in vitro vävnadsorganoidbildning och underlättade den mekaniska leveransen av celler till njurkapseln för transplantattransplantation. För att etablera dessa konstruktioner hölls basalmembranmatrisen först i ett flytande tillstånd under iskalla förhållanden. Cellaggregering uppnåddes därefter genom att skikta en konce…

Discussion

Aggregeringen av neonatala mjältceller inuti ett halvfast medium representerar en gångbar metod för att generera mjältkonstruktioner. Liknande basalmembranmatrisbaserade protokoll har använts för att initiera tredimensionella mjältkulturer¹⁰. Här visar vi att mjältkonstrukt är lika mottagliga för in vitro organoidodlingssystem som för in vivo transplantationsmodeller. Värt att notera är att transplantation av in vitro-odlade mjältorganoider ännu inte har …

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm