التصوير بالضوء للكشف عن بنية القلب في قلوب القوارض
Summary
يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
Abstract
يلعب المجهر ذو الصفيحة الضوئية (LSM) دورا محوريا في فهم البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) للقلب ، مما يوفر رؤى حاسمة في فسيولوجيا القلب الأساسية والاستجابات المرضية. نتعمق هنا في تطوير وتنفيذ تقنية LSM لتوضيح البنية الدقيقة للقلب في نماذج الفئران. تدمج المنهجية نظام LSM المخصص مع تقنيات إزالة الأنسجة ، مما يخفف من تشتت الضوء داخل أنسجة القلب للتصوير الحجمي. يسمح الجمع بين LSM التقليدي مع خياطة الصور وطرق إزالة الالتفاف متعددة الرؤية بالتقاط القلب بأكمله. لمعالجة المفاضلة المتأصلة بين الدقة المحورية ومجال الرؤية (FOV) ، نقدم أيضا طريقة مجهر الورقة الضوئية (ASLM) التي اجتاحتها محوريا لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري وإضاءة القلب بشكل موحد عبر اتجاه الانتشار. في غضون ذلك ، تعمل طرق إزالة الأنسجة مثل iDISCO على تعزيز تغلغل الضوء ، مما يسهل تصور الهياكل العميقة وضمان فحص شامل لعضلة القلب في جميع أنحاء القلب بأكمله. يقدم الجمع بين LSM المقترح وطرق إزالة الأنسجة منصة واعدة للباحثين في حل الهياكل القلبية في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
Introduction
لا يزال قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص القدرة على التجدد لخلايا عضلة القلب الناضجة1. تلعب البنية المعقدة للقلب دورا حاسما في وظيفته وتوفر نظرة ثاقبة للعمليات التنموية. يعد الفهم العميق لبنية القلب أمرا ضروريا لتوضيح العمليات الأساسية لتشكل القلب وإعادة تشكيله استجابة لاحتشاء عضلة القلب. وقد أظهر التقدم الأخير أن الفئران الوليدية يمكنها استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، في حين تفتقر الفئران البالغة إلى هذه القدرة على التجدد2. هذا يضع أساسا للتحقيق في الإشارات المرتبطة بالتشوهات الهيكلية والوظيفية في نماذج الماوس. طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود فنية ، بما في ذلك عمق الاختراق المقيد ، ونظام المسح البطيء للنقاط ، وتلف الصور الناتج عن التعرض الطويل لضوء الليزر. هذه تعيق التصوير الشامل ثلاثي الأبعاد (3D) للقلب السليم. في هذا السياق ، يظهر المجهر ذو الألواح الضوئية (LSM) كحل قوي ، حيث يوفر مزايا التصوير عالي السرعة وتقليل تلف الصور وقدرات التقسيم البصري الاستثنائية3،4،5. الميزات الفريدة ل LSM تضعها كطريقة واعدة للتغلب على قيود التقنيات التقليدية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة في تطوير القلب وعمليات إعادة التصميم6،7،8.
في هذا البروتوكول ، نقدم استراتيجية تصوير تجمع بين LSM المتقدم وأساليب إزالة الأنسجةالمعدلة 9 ، مما يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها دون الحاجة إلى وضع علامات محددة وتقسيم ميكانيكي. نقترح أيضا أنه يمكن تحسين تصوير LSM التقليدي من خلال تقنيات إزالة الالتفاف متعدد الرؤية10 أو تقنيات الفحص المجهري للصفائح الضوئية (ASLM)11،12،13،14،15 لتحسين الدقة المحورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج خياطة الصور مع أي من هذه الطرق إلى التغلب بشكل فعال على المفاضلة بين الدقة المكانية ومجال الرؤية (FOV) ، وبالتالي تطوير تصوير قلوب الفئران البالغة. يتيح دمج العديد من أساليب إزالة الأنسجة ، بما في ذلك الأساليب الكارهة للماء ، والمحبة للماء ، والقائمة على الهيدروجيل ، تغلغل أعمق للضوء لالتقاط مورفولوجيا القلب بأكمله16،17،18،19.
في حين أن طرق التطهير المتعددة متوافقة مع أنظمة LSM الحالية ، فإن الهدف هو تقليل تشتت الفوتون وتعزيز تغلغل الضوء في الأنسجة ، مثل القلب ، عن طريق استبدال الدهون بوسط يتطابق بشكل وثيق مع معامل الانكسار. تم اختيار iDISCO كممثل20,21 وتم تكييفه للتصوير الذاتي في هذا البروتوكول نظرا لمعالجته السريعة وشفافيته العالية (الشكل 1 أ). بشكل جماعي ، يوفر تكامل نهج LSM المتقدم مع تقنيات إزالة الأنسجة إطارا واعدا لكشف تشريح القلب المعقد في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لتشكل القلب والإمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وفر تقدم طرق التصوير والحساب وتنظيف الأنسجة فرصة لا مثيل لها للتحقيق على نطاق واسع في بنية القلب ووظيفته. هذا يحمل إمكانات كبيرة لتعميق فهمنا لتشكل القلب والتسبب في المرض باستخدام نموذج قلب القوارض السليم. على عكس الدراسات في الجسم الحي لقلب الزرد باستخدام نهج مماثل40</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعرب عن امتناننا لمجموعة الدكتور إريك أولسون في مركز UT Southwestern الطبي لمشاركتها بسخاء النماذج الحيوانية. نحن نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
Referências
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
