يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
يلعب المجهر ذو الصفيحة الضوئية (LSM) دورا محوريا في فهم البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) للقلب ، مما يوفر رؤى حاسمة في فسيولوجيا القلب الأساسية والاستجابات المرضية. نتعمق هنا في تطوير وتنفيذ تقنية LSM لتوضيح البنية الدقيقة للقلب في نماذج الفئران. تدمج المنهجية نظام LSM المخصص مع تقنيات إزالة الأنسجة ، مما يخفف من تشتت الضوء داخل أنسجة القلب للتصوير الحجمي. يسمح الجمع بين LSM التقليدي مع خياطة الصور وطرق إزالة الالتفاف متعددة الرؤية بالتقاط القلب بأكمله. لمعالجة المفاضلة المتأصلة بين الدقة المحورية ومجال الرؤية (FOV) ، نقدم أيضا طريقة مجهر الورقة الضوئية (ASLM) التي اجتاحتها محوريا لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري وإضاءة القلب بشكل موحد عبر اتجاه الانتشار. في غضون ذلك ، تعمل طرق إزالة الأنسجة مثل iDISCO على تعزيز تغلغل الضوء ، مما يسهل تصور الهياكل العميقة وضمان فحص شامل لعضلة القلب في جميع أنحاء القلب بأكمله. يقدم الجمع بين LSM المقترح وطرق إزالة الأنسجة منصة واعدة للباحثين في حل الهياكل القلبية في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.
لا يزال قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص القدرة على التجدد لخلايا عضلة القلب الناضجة1. تلعب البنية المعقدة للقلب دورا حاسما في وظيفته وتوفر نظرة ثاقبة للعمليات التنموية. يعد الفهم العميق لبنية القلب أمرا ضروريا لتوضيح العمليات الأساسية لتشكل القلب وإعادة تشكيله استجابة لاحتشاء عضلة القلب. وقد أظهر التقدم الأخير أن الفئران الوليدية يمكنها استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، في حين تفتقر الفئران البالغة إلى هذه القدرة على التجدد2. هذا يضع أساسا للتحقيق في الإشارات المرتبطة بالتشوهات الهيكلية والوظيفية في نماذج الماوس. طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود فنية ، بما في ذلك عمق الاختراق المقيد ، ونظام المسح البطيء للنقاط ، وتلف الصور الناتج عن التعرض الطويل لضوء الليزر. هذه تعيق التصوير الشامل ثلاثي الأبعاد (3D) للقلب السليم. في هذا السياق ، يظهر المجهر ذو الألواح الضوئية (LSM) كحل قوي ، حيث يوفر مزايا التصوير عالي السرعة وتقليل تلف الصور وقدرات التقسيم البصري الاستثنائية3،4،5. الميزات الفريدة ل LSM تضعها كطريقة واعدة للتغلب على قيود التقنيات التقليدية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة في تطوير القلب وعمليات إعادة التصميم6،7،8.
في هذا البروتوكول ، نقدم استراتيجية تصوير تجمع بين LSM المتقدم وأساليب إزالة الأنسجةالمعدلة 9 ، مما يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها دون الحاجة إلى وضع علامات محددة وتقسيم ميكانيكي. نقترح أيضا أنه يمكن تحسين تصوير LSM التقليدي من خلال تقنيات إزالة الالتفاف متعدد الرؤية10 أو تقنيات الفحص المجهري للصفائح الضوئية (ASLM)11،12،13،14،15 لتحسين الدقة المحورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج خياطة الصور مع أي من هذه الطرق إلى التغلب بشكل فعال على المفاضلة بين الدقة المكانية ومجال الرؤية (FOV) ، وبالتالي تطوير تصوير قلوب الفئران البالغة. يتيح دمج العديد من أساليب إزالة الأنسجة ، بما في ذلك الأساليب الكارهة للماء ، والمحبة للماء ، والقائمة على الهيدروجيل ، تغلغل أعمق للضوء لالتقاط مورفولوجيا القلب بأكمله16،17،18،19.
في حين أن طرق التطهير المتعددة متوافقة مع أنظمة LSM الحالية ، فإن الهدف هو تقليل تشتت الفوتون وتعزيز تغلغل الضوء في الأنسجة ، مثل القلب ، عن طريق استبدال الدهون بوسط يتطابق بشكل وثيق مع معامل الانكسار. تم اختيار iDISCO كممثل20,21 وتم تكييفه للتصوير الذاتي في هذا البروتوكول نظرا لمعالجته السريعة وشفافيته العالية (الشكل 1 أ). بشكل جماعي ، يوفر تكامل نهج LSM المتقدم مع تقنيات إزالة الأنسجة إطارا واعدا لكشف تشريح القلب المعقد في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لتشكل القلب والإمراض.
لقد وفر تقدم طرق التصوير والحساب وتنظيف الأنسجة فرصة لا مثيل لها للتحقيق على نطاق واسع في بنية القلب ووظيفته. هذا يحمل إمكانات كبيرة لتعميق فهمنا لتشكل القلب والتسبب في المرض باستخدام نموذج قلب القوارض السليم. على عكس الدراسات في الجسم الحي لقلب الزرد باستخدام نهج مماثل40</sup…
The authors have nothing to disclose.
نعرب عن امتناننا لمجموعة الدكتور إريك أولسون في مركز UT Southwestern الطبي لمشاركتها بسخاء النماذج الحيوانية. نحن نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).
1% Agarose | |||
Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | – | – | |
Chemicals for tissue clearing | |||
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Software and algorithms | |||
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
Key components of the customized light-sheet system | |||
0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
Filter | Chroma | ET525/30 | |
Filter | Chroma | ET585-40 | |
Filter | Chroma | ET645-75 | |
Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Stepper motor | Pololu | 1474 | |
Tube lens | Olympus | MVX-TLU |