Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen
Summary
Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.
Abstract
Die Lichtblattmikroskopie (LSM) spielt eine entscheidende Rolle beim Verständnis der komplizierten dreidimensionalen (3D) Struktur des Herzens und liefert entscheidende Einblicke in die grundlegende Herzphysiologie und pathologische Reaktionen. Wir befassen uns mit der Entwicklung und Implementierung der LSM-Technik, um die Mikroarchitektur des Herzens in Mausmodellen aufzuklären. Die Methodik integriert ein maßgeschneidertes LSM-System mit Gewebereinigungstechniken, um die Lichtstreuung im Herzgewebe für die volumetrische Bildgebung zu verringern. Die Kombination von konventionellem LSM mit Image Stitching und Multiview-Dekonvolutionsansätzen ermöglicht die Erfassung des gesamten Herzens. Um den inhärenten Kompromiss zwischen axialer Auflösung und Sichtfeld (FOV) zu adressieren, führen wir außerdem eine axial gesweepte Lichtblattmikroskopie (ASLM) Methode ein, um unscharfes Licht zu minimieren und das Herz gleichmäßig über die Ausbreitungsrichtung zu beleuchten. In der Zwischenzeit verbessern Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO die Lichtdurchdringung, erleichtern die Visualisierung tiefer Strukturen und gewährleisten eine umfassende Untersuchung des Myokards im gesamten Herzen. Die Kombination der vorgeschlagenen LSM- und Gewebereinigungsmethoden stellt eine vielversprechende Plattform für Forscher bei der Aufklärung kardialer Strukturen in Nagetierherzen dar, die ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.
Introduction
Herzinsuffizienz ist nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit, was vor allem auf die mangelnde Regenerationsfähigkeit reifer Kardiomyozytenzurückzuführen ist 1. Die komplizierte Architektur des Herzens spielt eine entscheidende Rolle für seine Funktion und gibt Einblicke in Entwicklungsprozesse. Ein tiefgreifendes Verständnis der kardialen Struktur ist unerlässlich, um die grundlegenden Prozesse der kardialen Morphogenese und des Umbaus als Reaktion auf einen Myokardinfarkt aufzuklären. Jüngste Fortschritte haben gezeigt, dass neugeborene Mäuse die Herzfunktion nach einer Verletzung wiederherstellen können, während erwachsenen Mäusen eine solche Regenerationsfähigkeit fehlt2. Dies schafft eine Grundlage für die Untersuchung von Hinweisen, die mit strukturellen und funktionellen Anomalien in Mausmodellen verbunden sind. Herkömmliche bildgebende Verfahren wie die konfokale Mikroskopie weisen technische Einschränkungen auf, darunter eine begrenzte Eindringtiefe, ein langsames Punktabtastschema und Lichtschäden durch längere Exposition gegenüber Laserlicht. Diese behindern eine umfassende dreidimensionale (3D) Darstellung des intakten Herzens. In diesem Zusammenhang erweist sich die Lichtblattmikroskopie (LSM) als leistungsstarke Lösung, die die Vorteile einer Hochgeschwindigkeitsbildgebung, reduzierter Lichtschäden und außergewöhnlicher optischer Schnittmöglichkeiten bietet 3,4,5. Die einzigartigen Eigenschaften der LSM machen sie zu einer vielversprechenden Methode, um die Grenzen konventioneller Techniken zu überwinden und beispiellose Einblicke in die kardialen Entwicklungs- und Umbauprozesse zu bieten 6,7,8.
In diesem Protokoll stellen wir eine Bildgebungsstrategie vor, die fortschrittliches LSM mit angepassten Gewebereinigungsansätzen9 kombiniert und die Bildgebung ganzer Mausherzen ermöglicht, ohne dass eine spezifische Markierung und mechanische Schnitte erforderlich sind. Wir schlagen ferner vor, dass die konventionelle LSM-Bildgebung durch Multiview-Dekonvolution10 oder axial gesweepte Lichtblattmikroskopie (ASLM) Techniken 11,12,13,14,15 verbessert werden kann, um die axiale Auflösung zu verbessern. Darüber hinaus kann die Integration von Image Stitching mit einer dieser Methoden den Kompromiss zwischen räumlicher Auflösung und Sichtfeld (FOV) effektiv überwinden und so die Bildgebung von adulten Mausherzen verbessern. Die Einbeziehung zahlreicher Gewebereinigungsansätze, einschließlich hydrophober, hydrophiler und hydrogelbasierter Methoden, ermöglicht eine tiefere Lichteindringung zur Erfassung der Morphologie des gesamten Herzens 16,17,18,19.
Während mehrere Clearing-Methoden mit aktuellen LSM-Systemen kompatibel sind, besteht das Ziel darin, die Photonenstreuung zu minimieren und die Lichtdurchdringung in Geweben wie dem Herzen zu verbessern, indem Lipide durch ein Medium ersetzt werden, das seinem Brechungsindex sehr nahe kommt. iDISCO wurde als Vertreter20,21 ausgewählt und aufgrund seiner schnellen Verarbeitung und hohen Transparenz für die Autofluoreszenzbildgebung in diesem Protokoll angepasst (Abbildung 1A). Insgesamt bietet die Integration des fortschrittlichen LSM-Ansatzes mit Gewebereinigungstechniken einen vielversprechenden Rahmen, um die komplizierte Herzanatomie in Nagetierherzen zu entschlüsseln, was ein erhebliches Potenzial für die Verbesserung unseres Verständnisses der kardialen Morphogenese und Pathogenese birgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Weiterentwicklung von Bildgebungs-, Berechnungs- und Gewebereinigungsmethoden hat eine beispiellose Gelegenheit geboten, die Struktur und Funktion des Herzens umfassend zu untersuchen. Dies birgt ein großes Potenzial für die Vertiefung unseres Verständnisses der kardialen Morphogenese und Pathogenese anhand eines intakten Nagetierherzmodells. Im Gegensatz zu In-vivo-Studien an Zebrafischherzen mit einem ähnlichen Ansatz 40,41,42,43 ermöglicht uns die Integration fortschrittlicher LSM-Techniken und Geweb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Gruppe von Dr. Eric Olson am UT Southwestern Medical Center für die großzügige Bereitstellung der Tiermodelle. Wir schätzen alle konstruktiven Kommentare von D-Inkubator-Mitgliedern an der UT Dallas. Diese Arbeit wurde von NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) und dem UT Dallas STARS-Programm (Y.D.) unterstützt.
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
Referências
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
