הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים
Summary
הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.
Abstract
מיקרוסקופ יריעות אור (LSM) ממלא תפקיד מרכזי בהבנת המבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) המורכב של הלב, ומספק תובנות חיוניות לגבי פיזיולוגיה בסיסית של הלב ותגובות פתולוגיות. אנו מתעמקים בזאת בפיתוח ויישום טכניקת LSM כדי להבהיר את המיקרו-ארכיטקטורה של הלב במודלים עכבריים. המתודולוגיה משלבת מערכת LSM מותאמת אישית עם טכניקות ניקוי רקמות, הפחתת פיזור האור בתוך רקמות הלב לצורך הדמיה נפחית. השילוב של LSM קונבנציונלי עם תפירת תמונה וגישות deconvolution multiview מאפשר ללכוד את הלב כולו. כדי להתמודד עם הפשרה המובנית בין רזולוציה צירית לשדה ראייה (FOV), אנו מציגים גם שיטת מיקרוסקופ יריעות אור שנסחף באופן אקסיאלי (ASLM) כדי למזער אור מחוץ למיקוד ולהאיר באופן אחיד את הלב לאורך כיוון ההתפשטות. בינתיים, שיטות ניקוי רקמות כגון iDISCO לשפר את חדירת האור, להקל על הדמיה של מבנים עמוקים ולהבטיח בדיקה מקיפה של שריר הלב לאורך הלב כולו. השילוב של שיטות LSM וניקוי רקמות המוצעות מהווה פלטפורמה מבטיחה לחוקרים בפתרון מבנים לבביים של מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצובה מחדש.
Introduction
אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים1. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו2. זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונזקי צילום כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור לייזר. אלה מעכבים הדמיה תלת ממדית מקיפה (3D) של הלב השלם. בהקשר זה, מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) מתגלה כפתרון רב עוצמה, המציע את היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה, נזק מופחת לצילום ויכולות חתך אופטיות יוצאות דופן 3,4,5. התכונות הייחודיות של LSM מציבות אותו כשיטה מבטיחה להתגבר על מגבלות הטכניקות הקונבנציונליות, ומספקות תובנות חסרות תקדיםעל התפתחות הלב ותהליכי שיפוץ 6,7,8.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיית הדמיה המשלבת LSM מתקדם עם גישות מותאמות לניקוי רקמות9, ומאפשרת הדמיה של לבבות עכבר שלמים ללא צורך בתיוג ספציפי ובחתך מכני. אנו מציעים גם כי ניתן לשפר את הדמיית LSM קונבנציונלית באמצעות טכניקות multiview deconvolution10 או מיקרוסקופ גיליון אור (ASLM) 11,12,13,14,15 כדי לשפר את הרזולוציה הצירית. בנוסף, שילוב של תפירת תמונה עם כל אחת מהשיטות הללו יכול להתגבר ביעילות על הפשרה בין רזולוציה מרחבית לשדה ראייה (FOV), ובכך לקדם את ההדמיה של לבבות עכברים בוגרים. השילוב של גישות רבות לניקוי רקמות, כולל שיטות הידרופוביות, הידרופיליות ומבוססות הידרוג’ל, מאפשר חדירת אור עמוקה יותר ללכידת המורפולוגיה של הלב כולו 16,17,18,19.
בעוד שיטות ניקוי מרובות תואמות למערכות LSM הנוכחיות, המטרה היא למזער את פיזור הפוטונים ולהגביר את חדירת האור ברקמות, כמו הלב, על ידי החלפת שומנים בתווך התואם באופן הדוק את מקדם השבירה שלו. iDISCO נבחרה כמייצגת20,21 והותאמה לדימות אוטופלואורסצנטי בפרוטוקול זה הודות לעיבוד המהיר והשקיפות הגבוהה שלה (איור 1A). באופן קולקטיבי, השילוב של גישת LSM המתקדמת עם טכניקות ניקוי רקמות מציע מסגרת מבטיחה לפענוח אנטומיה לבבית מורכבת בלבבות מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום הבנתנו במורפוגנזה ופתוגנזה של הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
התקדמות שיטות ההדמיה, החישוב וניקוי הרקמות סיפקה הזדמנות חסרת תקדים לחקור באופן נרחב את מבנה הלב ותפקודו. זה טומן בחובו פוטנציאל גדול להעמקת ההבנה שלנו של מורפוגנזה ופתוגנזה של הלב באמצעות מודל לב מכרסם שלם. בניגוד למחקרי in vivo של לב דג זברה בגישה דומה 40,41,42,43, השילוב של טכניקות LSM מתקדמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מביעים את תודתנו לקבוצתו של ד”ר אריק אולסון במרכז הרפואי UT Southwestern על שיתוף נדיב של דגמי בעלי החיים. אנו מעריכים את כל ההערות הבונות שסופקו על ידי חברי החממה D ב- UT דאלאס. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
Referências
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
