げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング
Summary
このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。
Abstract
ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。
Introduction
心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています1。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている2。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例のない洞察を提供します6,7,8。
このプロトコルでは、高度なLSMと適応した組織透明化アプローチ9を組み合わせたイメージング戦略を導入し、特定の標識や機械的切片化を必要とせずにマウス心臓全体のイメージングを可能にします。さらに、従来のLSMイメージングは、マルチビューデコンボリューション10または軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡(ASLM)技術11,12,13,14,15によって強化され、軸方向の分解能を向上させることができることを提案する。さらに、これらの方法のいずれかと画像スティッチングを統合することで、空間分解能と視野(FOV)のトレードオフを効果的に克服し、成体マウスの心臓のイメージングを進歩させることができます。疎水性、親水性、およびハイドロゲルベースの方法を含む多数の組織透明化アプローチを組み込むことにより、心臓全体の形態を捕捉するためのより深い光透過が可能になります16,17,18,19。
現在のLSMシステムとは複数のクリアリング方法と互換性がありますが、目標は、脂質を屈折率に近い媒体に置き換えることにより、光子散乱を最小限に抑え、心臓などの組織への光の透過性を高めることです。iDISCOは代表20,21として選択され、その迅速な処理と高い透明性により、このプロトコルの自家蛍光イメージングに適合しました(図1A)。全体として、高度なLSMアプローチと組織除去技術の統合は、げっ歯類の心臓の複雑な心臓解剖学的構造を解明するための有望なフレームワークを提供し、心臓の形態形成と病因の理解を深めるための大きな可能性を秘めています。
Protocol
動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC #21-03)の監督下で承認され、実施されています。この研究では、出生後1日目(P1)の新生児と8週齢の成人を含むC57BL6マウスを使用しました。雄と雌の間に差は観察されませんでした。すべてのデータ取得と画像後処理は、研究または教育ライセンスを取得したオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行?…
Representative Results
LSMは、明視野および点走査技術6,8,38,39,40のような他の光学イメージング方法とは対照的に、光損傷のリスクが最小限であり、高い空間分解能、および光学切片化により、心臓研究31,32,33,34,35,36,37を促進することが実証されている</su…
Discussion
イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合によ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
動物モデルを惜しみなく共有してくれたUTサウスウェスタンメディカルセンターのエリックオルソン博士のグループに感謝の意を表します。UTダラスのDインキュベーターメンバーから提供されたすべての建設的なコメントに感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUTダラスSTARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
Referências
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Citar este artigo
Almasian, M., Saberigarakani, A., Zhang, X., Lee, B., Ding, Y. Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts. J. Vis. Exp. (205), e66707, doi:10.3791/66707 (2024).