Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores
Summary
El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.
Abstract
La microscopía de lámina óptica (LSM) desempeña un papel fundamental en la comprensión de la intrincada estructura tridimensional (3D) del corazón, proporcionando información crucial sobre la fisiología cardíaca fundamental y las respuestas patológicas. A continuación, profundizamos en el desarrollo e implementación de la técnica LSM para dilucidar la microarquitectura del corazón en modelos de ratón. La metodología integra un sistema LSM personalizado con técnicas de limpieza de tejidos, mitigando la dispersión de la luz dentro de los tejidos cardíacos para la obtención de imágenes volumétricas. La combinación de LSM convencional con costura de imágenes y enfoques de deconvolución multivista permite la captura de todo el corazón. Para abordar la compensación inherente entre la resolución axial y el campo de visión (FOV), introducimos un método de microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) para minimizar la luz desenfocada e iluminar uniformemente el corazón en toda la dirección de propagación. Mientras tanto, los métodos de limpieza de tejidos, como iDISCO, mejoran la penetración de la luz, lo que facilita la visualización de estructuras profundas y garantiza un examen exhaustivo del miocardio en todo el corazón. La combinación de los métodos de LSM y limpieza de tejidos propuestos presenta una plataforma prometedora para los investigadores en la resolución de estructuras cardíacas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.
Introduction
La insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de mortalidad en todo el mundo, principalmente debido a la falta de capacidad regenerativa de los cardiomiocitos maduros1. La intrincada arquitectura del corazón desempeña un papel crucial en su función y proporciona información sobre los procesos de desarrollo. Una comprensión profunda de la estructura cardíaca es esencial para dilucidar los procesos fundamentales de la morfogénesis y la remodelación cardíaca en respuesta al infarto de miocardio. Avances recientes han demostrado que los ratones neonatos pueden restaurar la función cardíaca después de una lesión, mientras que los ratones adultos carecen dedicha capacidad regenerativa. Esto establece una base para investigar las señales asociadas con anomalías estructurales y funcionales en modelos de ratón. Los métodos de imagen tradicionales, como la microscopía confocal, tienen limitaciones técnicas, incluida la profundidad de penetración restringida, el esquema de escaneo de punto lento y el daño fotográfico por la exposición prolongada a la luz láser. Esto dificulta la obtención de imágenes tridimensionales (3D) completas del corazón intacto. En este contexto, la microscopía de lámina óptica (LSM) surge como una solución poderosa, que ofrece las ventajas de la obtención de imágenes de alta velocidad, la reducción del daño fotográfico y las capacidades excepcionales de corte óptico 3,4,5. Las características únicas de la LSM lo posicionan como un método prometedor para superar las limitaciones de las técnicas convencionales, proporcionando conocimientos sin precedentes sobre el desarrollo cardíaco y los procesos de remodelación 6,7,8.
En este protocolo, introducimos una estrategia de imagen que combina LSM avanzado con enfoques de limpieza de tejidos adaptados9, lo que permite la obtención de imágenes de corazones de ratón completos sin la necesidad de un etiquetado específico y un corte mecánico. Además, proponemos que las imágenes convencionales de LSM se pueden mejorar a través de técnicas de deconvolución multivista10 o microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) 11,12,13,14,15 para mejorar la resolución axial. Además, la integración de la unión de imágenes con cualquiera de estos métodos puede superar eficazmente el equilibrio entre la resolución espacial y el campo de visión (FOV), avanzando así en la obtención de imágenes de corazones de ratón adultos. La incorporación de numerosos enfoques de limpieza de tejidos, incluidos los métodos hidrofóbicos, hidrófilos y basados en hidrogel, permite una penetración más profunda de la luz para capturar la morfología de todo el corazón 16,17,18,19.
Si bien los múltiples métodos de eliminación son compatibles con los sistemas LSM actuales, el objetivo es minimizar la dispersión de fotones y mejorar la penetración de la luz en los tejidos, como el corazón, reemplazando los lípidos con un medio que coincida estrechamente con su índice de refracción. iDISCO fue elegido como el representativo20,21 y adaptado para la obtención de imágenes de autofluorescencia en este protocolo debido a su rápido procesamiento y alta transparencia (Figura 1A). En conjunto, la integración del enfoque avanzado de LSM con las técnicas de limpieza de tejidos ofrece un marco prometedor para desentrañar la intrincada anatomía cardíaca en corazones de roedores, con un potencial significativo para avanzar en nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíacas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El avance de los métodos de imagen, computación y limpieza de tejidos ha brindado una oportunidad sin precedentes para investigar exhaustivamente la estructura y función cardíaca. Esto tiene un gran potencial para profundizar nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíaca utilizando un modelo de corazón de roedor intacto. A diferencia de los estudios in vivo del corazón del pez cebra que utilizan un enfoque similar 40,41,42,43, la integración de técnicas avanzadas de LSM y métodos …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresamos nuestra gratitud al grupo del Dr. Eric Olson en UT Southwestern Medical Center por compartir generosamente los modelos animales. Agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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