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Bioengenharia

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

Published: March 29, 2024
doi:
10.3791/66707
, , , ,
1Department of Bioengineering,The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation,The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine,UT Southwestern Medical Center

Summary

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

Abstract

광시트 현미경(LSM)은 심장의 복잡한 3차원(3D) 구조를 이해하는 데 중추적인 역할을 하며, 기본적인 심장 생리학 및 병리학적 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이로써 우리는 마우스 모델에서 심장의 미세 구조를 밝히기 위해 LSM 기술의 개발 및 구현에 대해 탐구합니다. 이 방법론은 맞춤형 LSM 시스템과 조직 투명화 기술을 통합하여 체적 이미징을 위해 심장 조직 내 광 산란을 완화합니다. 기존 LSM과 이미지 스티칭 및 멀티뷰 디콘볼루션 접근 방식을 결합하면 심장 전체를 캡처할 수 있습니다. 축 방향 해상도와 시야(FOV) 사이의 본질적인 균형을 해결하기 위해 ASLM(Axially Swept Light-Sheet Microscopy) 방법을 도입하여 초점에서 벗어난 빛을 최소화하고 전파 방향에 걸쳐 심장을 균일하게 비춥니다. 한편, iDISCO와 같은 조직 투명화 방법은 빛 투과를 향상시켜 심부 구조의 시각화를 용이하게 하고 심장 전체의 심근을 종합적으로 검사할 수 있도록 합니다. 제안된 LSM과 조직 투명화 방법의 조합은 설치류 심장의 심장 구조를 해결하는 연구자에게 유망한 플랫폼을 제공하며, 심장 형태 형성 및 리모델링에 대한 이해를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

Introduction

심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 주로 성숙한 심근세포의 재생 능력 부족에 기인합니다1. 심장의 복잡한 구조는 심장의 기능에 중요한 역할을 하며 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 심장 구조에 대한 깊은 이해는 심근 경색에 대한 반응으로 심장 형태 형성 및 리모델링의 기본 과정을 설명하는 데 필수적입니다. 최근의 연구 결과에 따르면 신생아 마우스는 부상 후 심장 기능을 회복할 수 있는 반면, 성체 마우스는 이러한 재생 능력이 부족하다2. 이는 마우스 모델의 구조적 및 기능적 이상과 관련된 단서를 조사하기 위한 기반을 마련합니다. 컨포칼 현미경과 같은 기존 이미징 방법은 제한된 침투 깊이, 느린 포인트 스캐닝 방식, 레이저 광에 장기간 노출로 인한 사진 손상 등 기술적 한계가 있습니다. 이는 온전한 심장의 포괄적인 3차원(3D) 이미징을 방해합니다. 이러한 맥락에서 광시트 현미경(LSM)은 고속 이미징, 사진 손상 감소 및 탁월한 광학 절편 기능의 이점을 제공하는 강력한 솔루션으로 부상하고 있습니다 3,4,5. LSM의 고유한 특징은 기존 기술의 한계를 극복할 수 있는 유망한 방법으로 자리 매김하여 심장 발달 및 리모델링 과정에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다 6,7,8.

이 프로토콜에서는 고급 LSM과 적응된 조직 투명화 접근법9을 결합한 이미징 전략을 도입하여 특정 라벨링 및 기계적 절편 없이 전체 마우스 심장을 이미징할 수 있습니다. 또한, 종래의 LSM 이미징이 멀티뷰 디콘볼루션(multiview deconvolution)10 또는 축방향 스윕 광시트 현미경(ASLM) 기법(11,12,13,14,15)을 통해 향상되어 축 해상도를 향상시킬 수 있음을 제안한다. 또한 이러한 방법 중 하나와 이미지 스티칭을 통합하면 공간 해상도와 시야(FOV) 간의 균형을 효과적으로 극복할 수 있으므로 성인 마우스 심장의 이미징을 발전시킬 수 있습니다. 소수성, 친수성 및 하이드로겔 기반 방법을 포함한 수많은 조직 투명화 접근법의 통합은 전체 심장의 형태를 포착하기 위한 더 깊은 빛 투과를 가능하게 합니다 16,17,18,19.

현재 LSM 시스템에는 여러 가지 투명화 방법이 호환되지만, 목표는 지질을 굴절률과 밀접하게 일치하는 매질로 대체하여 광자 산란을 최소화하고 심장과 같은 조직에서 빛 투과를 향상시키는 것입니다. iDISCO는 대표적인20,21로 선정되었으며 빠른 처리와 높은 투명성으로 인해 이 프로토콜에서 자가형광 이미징에 적합했습니다(그림 1A). 종합적으로, 고급 LSM 접근법과 조직 투명화 기술의 통합은 설치류 심장의 복잡한 심장 해부학을 풀 수 있는 유망한 프레임워크를 제공하며, 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

Protocol

동물 프로토콜 및 실험은 텍사스 대학교 댈러스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC #21-03)의 감독하에 승인 및 수행되었습니다. 이 연구에는 출생 후 1일차(P1)의 신생아와 8주 된 성인을 포함한 C57BL6 마우스가 사용되었습니다. 남성과 여성 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 오픈 소스 소프트웨어 또는 플랫폼을 사용하여 수…

Representative Results

LSM은 명시야 및 포인트 스캐닝 기술과 같은 다른 광학 이미징 방법과 달리 사진 손상의 위험이 최소화되고 공간 해상도가 높으며 광학 절편이 가능하기 때문에 심장 연구(31,32,33,34,35,36,37)를 촉진하는 것으로 입증되었습니…

Discussion

이미징, 계산 및 조직 투명화 방법의 발전은 심장 구조와 기능을 광범위하게 조사할 수 있는 비할 데 없는 기회를 제공했습니다. 이는 온전한 설치류 심장 모델을 사용하여 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 심화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 유사한 접근법40,41,42,43을 사용한 제?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

동물 모델을 아낌없이 공유해 주신 UT Southwestern Medical Center의 Eric Olson 박사 그룹에 감사를 표합니다. UT Dallas의 D-incubator 회원들이 제공한 모든 건설적인 의견에 감사드립니다. 이 연구는 NIH R00HL148493(Y.D.), R01HL162635(Y.D.) 및 UT Dallas STARS 프로그램(Y.D.)의 지원을 받았습니다.

Materials

1% Agarose
Low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Deionized water – –
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans Sigma-Aldrich 118184
D.E.R.™ 332 Sigma-Aldrich 31185
D.E.R.™ 736 Sigma-Aldrich 31191
Dibenzyl ether (DBE) Sigma-Aldrich 33630
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
Fluorescent beads Spherotech FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma-Aldrich 216736
Methanol Sigma-Aldrich 439193
Paraformaldehyde (PFA) Thermo Fisher 47392
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich 79383
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Software and algorithms
Amira Thermo Fisher Scientific 2021.2
BigStitcher Hörl et al.22
Fiji-ImageJ Schindelin et al.20 1.54f
HCImage Live Hamamatsu Photonics 4.6.1.2
LabVIEW National Instruments Corporation 2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 – 6.3X Zoom body Olympus MVX-ZB10 
10X Illumination objective Nikon MRH00105
1X detection objective Olympus MV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS Laser Laserglow Technologies LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector National Instrument BNC-2110
Cylindrical lens Thorlabs ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes Physik Instrumente C-884.4DC
ETL Optotune EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable Optotune CAB-6-300
ETL Lens Driver Optotune EL-E-4i
Filter Chroma ET525/30
Filter Chroma ET585-40
Filter Chroma ET645-75
Filter wheel  Shutter Instrument LAMBDA 10-B
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.20DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.40DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente M-403.4PD
NI multifunction I/O National Instrument PCIe-6363
sCMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
Stepper motor Pololu 1474
Tube lens Olympus MVX-TLU
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Referências

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
  17. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
  32. Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).

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Almasian, M., Saberigarakani, A., Zhang, X., Lee, B., Ding, Y. Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts. J. Vis. Exp. (205), e66707, doi:10.3791/66707 (2024).
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