Method Article

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

DOI:

10.3791/66752

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April 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Abstract

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As células T auxiliares foliculares (TFH) são percebidas como uma linhagem independente de células T CD4+ que auxilia as células B cognatas na produção de anticorpos de alta afinidade, estabelecendo assim imunidade humoral de longo prazo. Durante a infecção viral aguda, o compromisso de destino das células TFH específicas do vírus é determinado na fase inicial da infecção, e as investigações das células TFH diferenciadas precocemente são cruciais para entender a imunidade humoral dependente de células T e otimizar o design da vacina. No estudo, usando um modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) e o camundongo SMARTA (SM) transgênico TCR com células T CD4 + reconhecendo especificamente o epítopo da glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, descrevemos procedimentos para acessar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus com base em colorações de citometria de fluxo. Além disso, ao explorar a transdução retroviral de células T SM CD4 + , métodos para manipular a expressão gênica em células TFH específicas de vírus diferenciados precocemente também são fornecidos. Portanto, esses métodos ajudarão em estudos que exploram o(s) mecanismo(s) subjacente(s) ao comprometimento precoce de células TFH específicas do vírus.

Introduction

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Encontrando diferentes patógenos ou ameaças, as células T CD4 + virgens adaptam suas respostas imunes diferenciando-se em vários subconjuntos de células T auxiliares (TH) com funções especializadas1. No cenário de infecção viral aguda, uma grande parcela de células T CD4+ virgens se diferencia em células T auxiliares foliculares (TFH) que fornecem ajuda às células B 2,3. Diferente de outros subconjuntos de células TH CD4 + (por exemplo, células TH1, TH2, TH9 e TH17), as células TFH expressam um nível substancial de CXCR5, que é o receptor de quimiocina para a quimiocina CXCL13 de células B, permitindo que as células TFH migrem para os folículos das células B. Nos folículos das células B, as células TFH auxiliam as células B cognatas a iniciar e manter as reações do centro germinativo, permitindo assim a rápida produção de anticorpos de alta afinidade e memória humoral de longo prazo 2,3.

Após a infecção viral aguda, o comprometimento precoce do destino das células TFH específicas do vírus ocorre dentro de 72 h 4,5 e é controlado pelo linfoma de células B repressor transcricional-6 (Bcl-6) 5 , 6 , 7 , 8 , que atua como o "regulador mestre" que governa as decisões de destino das células TFH. A deficiência de Bcl-6 embota severamente a diferenciação das células TFH, enquanto a expressão ectópica de Bcl-6 promove substancialmente o compromisso do destino das células TFH. Além do Bcl-6, várias moléculas estão envolvidas na instrução do comprometimento precoce do destino das células TFH. Os fatores de transcrição TCF-1 e LEF-1 iniciam a diferenciação de células TFH por meio da indução de Bcl-6 9,10,11. A inibição do Blimp1, tanto por Bcl-6 quanto por TCF-1, é necessária para o comprometimento precoce do destino das células TFH 11,12. STAT1 e STAT3 também são necessários para a diferenciação precoce de células TFH 13. Além disso, as modificações epigenéticas pela histona metiltransferase EZH214,15 e m6A metiltransferase METTL316 ajudam a estabilizar os programas transcricionais de células TFH (especialmente Bcl6 e Tcf7) e, assim, preparar o compromisso inicial do destino das células TFH. Embora avanços, incluindo as moléculas acima mencionadas e outras, resumidas em outro lugar3, tenham sido feitos na compreensão dos regulamentos transcricionais e epigenéticos do compromisso inicial do destino das células TFH, moléculas anteriormente desconhecidas ainda precisam ser aprendidas.

No modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV), as células T CD4+ SMARTA (SM) congênitas transgênicas TCR transferidas adotivamente, que reconhecem especificamente o epítopo da glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, sofrem diferenciação de células TFH ou TH1 durante a infecção viral. Este padrão de diferenciação de bifurcação TFH /T H1 suporta o avanço do modelo de infecção SM / LCMV aguda no estudo da biologia de células TFH específicas do vírus. De fato, o modelo de infecção SM/LCMV agudo tem sido amplamente utilizado no campo de pesquisa de células TFH e desempenhou um papel crucial nas descobertas marcantes na biologia celular TFH. Isso inclui a identificação do Bcl-6 mencionado acima como o fator de transcrição definidor de linhagem de células TFH 5,6, bem como outros fatores transcricionais importantes (por exemplo, Blimp-16, TCF-1 / LEF 9,10,11, STAT1 / STAT313, STAT517, KLF218 e Itch19) orientando a diferenciação de células TFH, regulações pós-transcricionais ( por exemplo, METTL316 e miR-17 ~ 9220) da diferenciação de células TFH, memória e plasticidade de células TFH 21,22 e estratégias racionais de vacinação direcionadas às células TFH (por exemplo, selênio23).

O presente estudo descreve métodos reprodutíveis para acessar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus, incluindo (1) estabelecer um modelo de camundongo quimera SM infectado com LCMV agudo adequado para acessar células TFH diferenciadas precocemente, (2) realizar colorações de citometria de fluxo de moléculas relacionadas a células TFH diferenciadas precocemente e (3) realizar manipulação de genes baseada em vetor retroviral em SM CD4 + Células T. Esses métodos serão úteis para estudos que investigam o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus.

Protocol

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Todos os experimentos com animais foram conduzidos seguindo procedimentos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Terceira Universidade Médica Militar. As seguintes linhagens de camundongos foram utilizadas no presente estudo: camundongo C57BL/6J (B6) (ambos os sexos), com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; camundongo transgênico CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; e camundongo transgênico CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico × CXCR5-GFP knock-in), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g. As espécies transgênicas foram geradas após um relatório publicado anteriormente24. Os detalhes dos reagentes, tampões e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Colheita de células T CD45.1+ SM CD4+ para transferência adotiva

  1. Eutanasiar (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) o número necessário de camundongos SM CD45.1+ TCR-transgênicos de 6 a 8 semanas de idade24. Faça uma incisão de 1 polegada à esquerda da parede peritoneal dos camundongos eutanasiados com tesoura cirúrgica, disseque os baços do peritônio e rasgue o tecido conjuntivo atrás do baço25,26.
  2. Coloque cada baço em um filtro de células de 70 μm dentro de uma placa de Petri (60 mm × 15 mm) e triture o baço com 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) usando um êmbolo de seringa de 1 mL.
    NOTA: Use o lado redondo do êmbolo da seringa para triturar o baço até que apenas o tecido conjuntivo permaneça.
  3. Adicione 6 mL de RPMI + 2% de FBS (RPMI 2%) em cada prato para diluir 3 mL de tampão de lise de hemácias. Pipetar as suspensões celulares para um tubo cónico de 15 ml a partir da placa. Enxágue o prato com mais 3 mL de 2% RPMI e transfira para o mesmo tubo cônico.
  4. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda as células com um tampão de isolamento e ajuste a densidade celular para ~ 1 × 108 células por mL. Coloque o tubo no gelo.
  5. Prepare um coquetel de anticorpos biotinilados 1x contra CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c e Ter119 em tampão isolado para o enriquecimento de células T CD4+ .
    NOTA: Adicione anticorpos biotinilados ao tampão de isolamento na diluição indicada, conforme mencionado na Tabela de Materiais. Manter o volume do cocktail de anticorpos igual ao do tampão de isolamento indicado no passo 1.4.
  6. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação.
  7. Ressuspenda o pellet celular com o coquetel de anticorpos biotinilados 1x indicado no tubo cônico.
  8. Coloque o tubo cônico no gelo em uma coqueteleira por 30 min a 45 rpm.
  9. Durante a incubação com anticorpos biotinilados, prepare o volume necessário de esferas revestidas de estreptavidina de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Os esplenócitos totais de um camundongo virgens precisam de 200 μL de esferas revestidas com estreptavidina.
  10. Lave as células centrifugando a 800 x g com 8-10 ml de tampão de isolamento durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante. Repita esta etapa por mais duas vezes.
  11. Ressuspenda o pellet celular com esferas revestidas de estreptavidina preparadas.
  12. Coloque o tubo no gelo em uma coqueteleira por 40 min a 45 rpm.
  13. Em seguida, coloque o tubo em um suporte magnético por 3-4 min até que todas as contas estejam montadas no lado magnético.
  14. Recolha cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo cónico de 15 ml.
  15. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação.
    NOTA: Existem outros kits comerciais disponíveis para enriquecimento de células T CD4+ , que podem ser usados como substitutos para o procedimento de enriquecimento de células T CD4+ descrito nas etapas 1.5-1.15.
  16. Ressuspenda o pellet celular com 2-3 mL de 2% de RPMI. Aspirar 50 μL de suspensão celular para análise de citometria de fluxo da eficiência do enriquecimento de células T CD4+ (CD4 e Vα2) e viabilidade celular.
  17. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda o pellet celular com RPMI e ajuste a densidade celular para 1 ×10 7 células CD4 + Vα2 + SM por mL. Coloque o tubo no gelo e avance para a transferência de células adotivas na próxima etapa.

2. Estabelecendo o modelo de camundongo quimera SM infectado por LCMV agudo para acessar células T FH SM diferenciadas precocemente

  1. Aqueça os camundongos receptores C57BL / 6 de 6 a 8 semanas de idade com uma lâmpada infravermelha para dilatar a veia da cauda para injeção intravenosa.
  2. Aspirar 100 μL de suspensão celular contendo 1 × 106 células SM preparadas na etapa 1.17 com uma seringa de insulina.
    NOTA: O volume de injeção deve ser modificado por cada pesquisador e não deve exceder o volume máximo de injeção permitido pela legislação institucional e local.
  3. Segure os ratos no lugar com um fixador de rato, endireite a cauda e limpe a cauda com etanol a 75% usando uma bola de algodão para tornar a veia da cauda visível.
  4. Insira a agulha da seringa de insulina na veia da cauda e injete as suspensões celulares de forma suave e lenta. Em seguida, deixe os ratos receptores descansarem durante a noite.
  5. No dia seguinte, diluir o estoque de vírus LCMV Armstrong com meio RPMI para atingir uma concentração final de 1 × 107 unidades formadoras de placas/mL.
  6. Injectar 100 μL de solução diluída de LCMV Armstrong (contendo 1 × 106 unidades formadoras de placas) na veia da cauda dos ratinhos receptores.
    NOTA: Cada pesquisador deve ser cauteloso sobre se o título infeccioso recomendado é permitido pela legislação institucional e local.

3. Colorações de citometria de fluxo de células T TFH SM diferenciadas precocemente

  1. Sacrifique os camundongos (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) da etapa 2.6 no dia 3 após a infecção e processe os linfócitos dos baços conforme descrito na etapa 1. Ajuste a densidade celular para aproximadamente 2 × 107 células por mL.
  2. Carregue 50 μL de suspensões celulares (~ 1 × 106 células) em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complete com 150 μL de tampão de coloração por poço. Mantenha o prato no gelo.
  3. Prepare o coquetel de anticorpos anti-camundongo CXCR5 purificado de rato (ou seja, anticorpo primário CXCR5) em uma diluição de 1:50 em 50 μL de tampão de coloração de células TFH para cada amostra em um tubo. Vortex completo do tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
  4. Centrifugar a placa de 96 poços a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
  5. Repita a etapa 3.4 e ressuspenda as células com 50 μL do anticorpo primário CXCR5 por poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 1 h.
  6. Prepare o coquetel de anticorpos anti-rato de cabra biotinilada (ou seja, anticorpo secundário CXCR5) em uma diluição de 1:200 em 50 μL de tampão de coloração de células TFH para cada amostra em um novo tubo. Vortex o tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
  7. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
  8. Repita a etapa 3.7 duas vezes e mantenha o prato no gelo.
  9. Adicione 50 μL de anticorpo secundário CXCR5 por alvéolo à placa. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 min.
  10. Prepare estreptavidina conjugada com fluorescência (ou seja, anticorpo terciário CXCR5) em uma diluição de 1:200 em 50 μL de tampão de coloração de células TFH para cada amostra. Enquanto isso, adicione outros anticorpos contra marcadores de superfície (por exemplo, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 e outras moléculas interessadas) e a coloração de células mortas junto com o anticorpo terciário CXCR5.
  11. Vortex o tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
  12. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
  13. Repita a etapa 3.12 duas vezes e mantenha o prato no gelo.
  14. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos terciários CXCR5 por alvéolo à placa. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
  15. Prepare 200 μL de tampão de fixação/permeabilização para cada poço de acordo com as instruções do fabricante.
  16. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
  17. Repita a etapa 3.16 duas vezes e mantenha o prato no gelo no escuro.
  18. Adicione 200 μL de tampão de fixação/permeabilização em cada poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incubando em temperatura ambiente por 30 min (no escuro).
    NOTA: Prepare o tampão de permeabilização (1x) de acordo com as instruções do fabricante.
  19. Prepare o coquetel de anticorpos contra fatores transcricionais, incluindo Bcl-6, TCF-1, T-bet e outras moléculas interessadas, em 50 μL de tampão de permeabilização (1x) para cada poço em um novo tubo.
  20. Vortex o tubo e centrifugue a 15.000 x g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas.
  21. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, vórtice breve da placa e adicionar 50 μl de cocktail de anticorpos do factor de transcrição por alvéolo. Misture bem e incube no gelo por 30 min no escuro.
  22. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante, submeter brevemente o vórtice da placa por decantação e adicionar 200 μL de tampão de permeabilização (1x) por alvéolo.
  23. Repita a etapa 3.22.
  24. Adicione 200 μL de tampão de coloração em cada poço, centrifugue a placa a 800 × g por 1 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante por decantação e subalterne brevemente a placa em vórtice.
  25. Ressuspenda o pellet celular em cada poço com 200 μL de tampão de coloração e transfira as células para tubos de citometria de fluxo para análise imediata do citômetro de fluxo.
    NOTA: Alternativamente, as amostras podem ser detectadas dentro de 3 dias nas condições de adicionar 200 μl de PFA a 2% em cada tubo e serem armazenadas a 4 ° C no escuro.

4. Produção de retrovírus

  1. Cultive as células 293T (com menos de dez passagens) com meio DMEM 10% em uma placa de cultura de 10 cm por uma duração de 2-3 passagens.
  2. Quando as células atingirem 90% de confluência, descarte o meio antigo e lave suavemente as células com PBS duas vezes, seguido de breve tripsinização das células 293T usando 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% em temperatura ambiente por 1 min.
  3. Pare o processo de digestão ressuspendendo as células em 2 mL de meio DMEM a 10% pré-aquecido, transferindo-as para um tubo cônico de 15 mL e centrifugando a 200 × g por 5 min a 4 ° C.
  4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular pipetando para cima e para baixo os meios de cultura com 2 mL de meio DMEM a 10% pré-aquecido.
  5. Quantifique o número de células e a placa 5 × 105 células em 2,5 mL de meio DMEM a 10% por poço em uma placa de 6 poços.
    NOTA: Gire o prato suavemente para permitir que as células 293T se espalhem uniformemente por todo o prato.
  6. Quando a confluência de células 293T exceder 80%, prepare os reagentes de transfecção conforme descrito nas etapas 4.7 a 4.9.
  7. Para cada poço de uma placa de 6 poços, adicione 250 μL de meio Opti-MEM pré-aquecido em um tubo estéril de 1,5 mL. Em seguida, adicione 3 μg de DNA de plasmídeo (contendo 2 μg de vetor retroviral e 1 μg de pCL-Eco) ao meio Opti-MEM, seguido de pipetagem suave para cima e para baixo para garantir uma mistura completa.
    NOTA: Os vetores retrovirais empregados como exemplos neste estudo são o vetor MigR1 e o vetor MigR1 modificado com região Bcl6 CDS a montante do IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Em seguida, adicione 7,5 μL de reagente de transfecção pré-aquecido (obtido comercialmente) à mistura e pipete suavemente para cima e para baixo para garantir uma mistura completa.
  9. Incube a mistura em temperatura ambiente por 20 min.
  10. Dispense a mistura gota a gota em regiões distintas do poço cultivado em células 293T, seguido de balançar suavemente o recipiente de cultura em um movimento para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme da mistura.
  11. Incubar as células 293T durante 72 h numa incubadora a 37 °C contendo 5% de CO2.
  12. Detecte a marca do vetor retroviral como o proxy para a eficácia da transfecção nas células 293T transfectadas usando um microscópio de fluorescência ou citometria de fluxo.
    NOTA: Por exemplo, confirmamos o sinal de fluorescência GFP em uma proporção significativa de células 293T transfectadas por vetor MigR1, sugerindo transfecção de alta qualidade.
  13. Colete o meio de cultura celular e centrifugue a 2.500 × g por 10 min a 4 °C para eliminar os detritos celulares. O sobrenadante resultante deve ser cuidadosamente recolhido e armazenado para conservação a longo prazo a -80 °C ou temporariamente mantido a 4 °C.

5. Ativação in vivo, transdução de retrovírus e transferência adotiva de células T SM CD4+

  1. Injete um camundongo CD45.1+ SM (6 a 8 semanas de idade) por via intravenosa com 200 μg de LCMV GP61-77 peptídeo11,14 em um volume de 100 μL de meio RPMI.
    NOTA: O volume de injeção deve ser modificado por cada pesquisador e não exceder o volume máximo de injeção permitido pela instituição e pela legislação local.
  2. Eutanasiar o camundongo SM 16-18 h após a injeção do peptídeo (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Adquira os esplenócitos seguindo os procedimentos mencionados acima na etapa 1.
    NOTA: Alternativamente, o método de estimulação in vitro anti-CD3 / anti-CD2827,28 pode ser usado para ativar células T SM CD4 + no lugar da estimulação peptídica in vivo descrita nas etapas 5.1 e 5.2.
  3. Suspenda os esplenócitos com 2% de RPMI e ajuste a densidade celular para aproximadamente 1 × 108 células por mL em um tubo cônico de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo.
  4. Dispense 50 μL de suspensão celular em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complemente com 150 μL de tampão de coloração por poço.
  5. Centrifugue a placa de 96 poços a 800 × g por 1 min a 4 ° C para granular as células, remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação, subtraia brevemente a placa e adicione 200 μL de tampão de coloração por poço.
  6. Repita a etapa 5.5 e ressuspenda as células com 50 μL de coquetel de anticorpos de superfície, incluindo CD4, CD25 e CD69, para detectar o status de ativação das células T SM CD4 + . Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
  7. Complete cada poço com tampão de coloração a 200 μl, seguido de centrifugação da placa a 800 × g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e vortex breve da placa.
  8. Repita a etapa 5.7 duas vezes.
  9. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão de coloração e transfira-as para um tubo de citometria de fluxo.
  10. Analise as células coradas com anticorpos conjugados com fluorescência com uma citometria de fluxo para avaliar o estado de ativação das células T SM CD4+ .
    NOTA: As células T SM CD4+ ativadas exibiram expressões abundantes de CD25 e CD69 em comparação com as células virgens, permitindo assim procedimentos de transdução subsequentes.
  11. Adicione 1 × 106 células T CD4 + SM (da etapa 5.3) por poço em uma placa de 24 poços. Centrifugar as células a 800 × g durante 3 min a 4 °C e, em seguida, remover cuidadosamente o meio por decantação.
  12. Adicione 1 ml de meio retroviral conforme descrito no passo 4.13 e 8 μg de polibreno a cada alvéolo.
  13. Transduzir as células a 800 × g durante 2 h a 37 °C.
  14. Descarte cuidadosamente o meio retroviral pipetando e adicione 1 mL de RPMI a 10% pré-aquecido suplementado com 10 ng/mL de IL-2 murina recombinante a cada poço.
  15. Incubar as células durante 48 h numa incubadora a 37 °C contendo 5% de CO2.
  16. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire as células a 800 × g por 6 min a 4 ° C.
  17. Remover o sobrenadante por decantação e ressuspender as células com um volume adequado de 2% RPMI para perfazer uma densidade celular de 1 × 108 células por ml num tubo cónico de 15 ml. Mantenha o tubo no gelo.
  18. Dispense 50 μL de suspensão celular em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complemente com 150 μL de tampão de coloração por poço.
  19. Centrifugue a placa de 96 poços a 800 × g por 1 min a 4 ° C para granular as células, remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação, subtraia brevemente a placa e adicione 200 μL de tampão de coloração por poço.
  20. Repita a etapa 5.19 e ressuspenda as células com 50 μL de coquetel de anticorpos de superfície, incluindo CD4, Vα2 e anticorpo associado a marcação vetorial. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
  21. Complete cada poço com tampão de coloração até 200 μL, seguido de centrifugação da placa a 800 × g por 1 min. Descarte o sobrenadante por decantação e vortex breve da placa.
  22. Repita a etapa 5.21 duas vezes.
  23. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão de coloração e transfira-as para um tubo de citometria de fluxo.
  24. Analise as células coradas com anticorpos conjugados com fluorescência com citometria de fluxo para avaliar a eficiência da transdução em células T SM CD4+ .
    NOTA: As células T SM CD4 + eficientemente transduzidas exibiram alta expressão da marca de retrovírus, como GFP, no estudo.
  25. Centrifugar as suspensões celulares do passo 5.17 a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda o pellet celular com RPMI e ajuste a densidade celular para 1 ×10 7 células CD4 + Vα2 + SM / mL.
  26. Transfira adotivamente um número total de 1 ×10 6 células T CD45.1+ SM CD4+ para cada camundongo receptor C57BL/6 (6 a 8 semanas de idade) por uma injeção intravenosa de 100 μL de suspensão celular na etapa 5.25.
  27. No dia seguinte, infecte camundongos receptores C57BL / 6 com 1 × 106 unidades formadoras de placas LCMV Armstrong por meio de injeção intravenosa.

6. Análise por citometria de fluxo de células SMT FH transduzidas por retrovírus no estágio inicial da infecção aguda por LCMV

  1. Adquira os esplenócitos de camundongos C57BL/6 da etapa 5.25 no dia 3 após a infecção.
  2. Realize a coloração por citometria de fluxo de marcadores de superfície, incluindo CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 e outras moléculas interessadas, em esplenócitos, conforme descrito na etapa 3.
  3. Para a detecção de fatores transcricionais em células T SM CD4+ transduzidas com retrovírus marcados por proteínas fluorescentes, adicione 200 μL de PFA a 2% a cada poço e incube em temperatura ambiente por 20 min no escuro.
  4. Realize a fixação/permeabilização, a coloração por citometria de fluxo dos fatores transcricionais interessados e realize a análise de citometria de fluxo conforme descrito na etapa 3.

Results

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Características das células TFH específicas do vírus de diferenciação precoce durante a infecção aguda por LCMV
Para investigar o compromisso de destino inicial de células TFH específicas do vírus, células T SM CD4 + congênitas virgens que reconhecem especificamente o epítopo LCMV GP IA, A,B GP66-77, foram transferidas adotivamente para receptores CD45.2 + C57BL / 6. No dia seguinte, esses receptores foram infectados por via intravenosa com uma alta dose de LCMV Armstrong agudamente resolvido (Figura 1A). No dia 3 após a infecção, os esplenócitos dos receptores C57BL/6 foram analisados por citometria de fluxo, e os resultados indicaram uma grande quantidade de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas (~10% do total de células T CD4+) (Figura 1B), o que forneceu um número suficiente de células T CD4+ específicas para o vírus para investigação posterior. Análises adicionais de células T CD4+ SM transferidas mostraram co-expressão de CXCR5 e Bcl-6/TCF-1 e expressão recíproca de CXCR5 e CD25/T-bet, definindo assim as linhagens TFH (CXCR5+Bcl-6+ ou CXCR5+TCF-1+) e TH1 (CXCR5-CD25+ ou CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Para avaliar a especificidade e a sensibilidade da coloração de anticorpos CXCR5 apresentada no estudo, cruzamos ainda mais a linha de camundongos CD45.1+ SM acima mencionada com a linha de camundongos CXCR5-GFP knock-in, que foi gerada pela inserção de uma construção IRES-GFP após o quadro de leitura aberto de Cxcr529. Em seguida, as células SM repórter CD45.1+ CXCR5-GFP foram transferidas para receptores C57BL/6. Esses receptores foram infectados com LCMV Armstrong e seus esplenócitos foram analisados no dia 3 após a infecção. De fato, o sinal de fluorescência pelo método de coloração de anticorpos CXCR5 no estudo se sobrepôs finamente ao sinal GFP em células T CXCR5-GFP repórter29 SM CD4 + transferidas no dia 3 após a infecção (Figura 1D), indicando a alta especificidade do método de coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas.

Superexpressão de Bcl-6 baseada em retrovírus em células T SM CD4+
A Bcl-6 é uma das moléculas mais importantes na promoção da diferenciação de células TFH 6,7,8. Para verificar a confiabilidade do protocolo atual no acesso a células TFH diferenciadas precocemente, as células T CD45.1+ SM CD4+ foram ativadas in vivo e transduzidas com sobrenadante de retrovírus de células 293T transfectadas por plasmídeo de plasmídeo de superexpressão de MigR1 ou MigR1-Bcl6 (Figura 2 e Figura 3A). As células T SM CD4 + transduzidas por retrovírus foram transferidas adotivamente para receptores C57BL / 6, que foram então infectados com LCMV Armstrong ( Figura 3B ). No dia 3 após a infecção, encontramos uma bifurcação equilibrada de células TFH e TH1 em células T MigR1-SM CD4 +, enquanto uma diferenciação predominante direcionada a células TT FH em células T MigR1-Bcl6-SM CD4 + (Figura 3C). Consistentemente, o nível de expressão de Bcl-6 foi aumentado em células T CD4 + MigR1-Bcl6-SM em comparação com células T MigR1-SM CD4 + (Figura 3D). Portanto, o fenótipo que a diferenciação de células TFH 6 orientada pela expressão ectópicade Bcl-6 foi finamente reproduzido seguindo o protocolo atual.

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Figura 1: Análises de citometria de fluxo do comprometimento precoce do destino de células SMT FH durante a infecção por LCMV Armstrong. (A) Projeto experimental. As células T CD4+ esplênicas foram colhidas de camundongos CD45.1+ SM e, em seguida, transferidas adotivamente para receptores C57BL/6 (CD45.2+). No dia seguinte, esses receptores foram infectados com LCMV Armstrong. No dia 3 após a infecção, as células SM CD45.1+ transferidas dos baços dos receptores foram analisadas por citometria de fluxo. (B) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando a estratégia de gating de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas dos baços dos receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. (C) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando co-colorações de CXCR5 e outras moléculas associadas a células TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 e T-bet) em células CD45.1+ SM transferidas dos baços de receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. (D) Dados representativos de citometria de fluxo mostrando co-colorações de anticorpo conjugado com fluorescência contra CXCR5 e sinal GFP em células SM repórter CD45.1+ CXCR5-GFP transferidas dos baços dos receptores no dia 3 após a infecção por LCMV Armstrong. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Transdução retroviral em células T SM CD4+ . (A) Diagrama esquemático de produção e transdução retroviral em células T SM CD4+ . Para a produção de retrovírus, as células 293T semeadas em uma placa de 6 poços foram transfectadas com plasmídeos de DNA alvo quando a densidade celular atinge ≥80% de confluência. Em seguida, o sobrenadante de cultura celular contendo retrovírus foi coletado 72 h após a transfecção e imediatamente usado ou armazenado a -80 °C. Para transdução retroviral em células T SM CD4+ , um camundongo CD45.1+ SM foi injetado por via intravenosa com 200 μg de LCMV GP61-77 Em seguida, o baço foi dissecado de camundongo SM 16-18 h após a injeção do peptídeo, e o status de ativação das células T CD4+ esplênicas foi detectado. As células T SM CD4+ ativadas foram transduzidas com sobrenadante de cultura contendo retrovírus e cultivadas in vitro por 48 h antes de acessar a eficiência de transdução. (B) Imagem de microscopia de fluorescência de GFP em células 293T transfectadas por DNA plasmidial. Barra de escala: 400 μm. (C) Análise por citometria de fluxo dos níveis de expressão de CD25 e CD69 em células T CD4+ virgens esplênicas de camundongo virgem (virgen, à esquerda) ou células T SM CD4+ esplênicas de camundongo SM injetado com peptídeo LCMV GP61-77 (ativado, à direita). (D) Análise de citometria de fluxo da expressão de GFP em células T SM CD4+ transduzidas por retrovírus (transduzidas, à esquerda) ou células T SM CD4+ não transduzidas por retrovírus (não transduzidas, à esquerda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Efeitos da superexpressão de Bcl-6 no compromisso do destino das células SM TFH. (A) Mapas lineares de backbones retrovirais de MigR1 (painel superior) e vetor MigR1 modificado com região Bcl6 CDS a montante de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (painel inferior). (B) Desenho experimental. As células T SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6 foram transferidas adotivamente para receptores C57BL/6 (CD45.2+) um dia antes do LCMV Armstrong. No dia 3 após a infecção, as células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas do baço dos receptores foram analisadas por citometria de fluxo. (C) Análise de citometria de fluxo de CXCR5 e CD25 em células T GFP+ SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6. Os números adjacentes à porta indicam as frequências das células TFH nas células T SM CD4+. (D) Análise de citometria de fluxo do nível de expressão de Bcl-6 em células T SM CD4+ transduzidas por MigR1 ou MigR1-Bcl6. MFI, intensidade média de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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A pesquisa no campo das células TFH tem sido destacada desde a descoberta da função especializada das células TFH em ajudar as células B. Estudos acumulados indicaram que a diferenciação de células TFH é um processo multiestágio e multifatorial30, em que o compromisso do destino das células TFH é determinado no estágio inicial5. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às células TFH diferenciadas precocemente é crucial para a biologia das células TFH e o design racional da vacina. Aqui, fornecemos métodos para acessar o compromisso de destino inicial de células TFH específicas do vírus e para manipular a expressão gênica em células TFH diferenciadas precocemente, explorando o modelo de infecção viral LCMV Armstrong, camundongo SM transgênico TCR e transdução mediada por retrovírus.

O receptor de quimiocina CXCR5 é um importante marcador de superfície que distingue as células TFH de outros subconjuntos de células TH CD4 + 6,7,8,31, necessitando assim do método de coloração CXCR5 de alta especificidade e sensibilidade na pesquisa com células T FH. No estudo, um método de coloração de estreptavidina-biotina CXCR5 em três etapas foi demonstrado na identificação do subconjunto de células TFH (Figura 1C). Embora a perda de especificidade seja um problema complicado para abordagens de coloração de anticorpos de dois ou três estreptococos de alta sensibilidade, verificou-se que o sinal de fluorescência pela coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas se sobrepôs quase completamente ao sinal GFP em células T CXCR5-GFP29 repórter SM CD4 + no dia 3 após a infecção (Figura 1D), sugerindo a obtenção de especificidade e sensibilidade pelo método de coloração de anticorpos CXCR5 em três etapas. De fato, essa estratégia de coloração CXCR5 de três estreptococos é testada e confiável e ajudou os pesquisadores a investigar melhor a biologia das células TFH 11,14,15,21, bem como outros tipos de células T que expressam CXCR5 29,32.

Após a infecção e imunização, o compromisso com o destino das células TFH é geralmente modelado por uma diferenciação bifurcada de células T CD4 + virgens em células TFH ou células TH efetoras não TFH 2,3,30. Este estudo mostrou a bifurcação equilibrada de células TFH e TH1 em células T SM CD4 + transferidas. Além disso, essas células T CD4+ SM transferidas são de quantidade celular adequada no estágio inicial da infecção, atuando assim como um modelo adequado para estudar a diferenciação de células TFH. Certamente, a expressão ectópica de Bcl-6 mediada por retrovírus em células T SM CD4+ transferidas foi fortemente tendenciosa para a diferenciação de células TFH em comparação com a de células T CD4+ de controle (86,6% vs. 53,8%) (Figura 3C), o que está alinhado com o relatório anterior6 e comprova ainda mais a precisão dos protocolos descritos no estudo. Alternativamente, os protocolos acima mencionados também podem ser aplicados ao knock-down mediado por retrovírus de genes interessados (por exemplo, bcl6, Tcf7) em células T SM CD4 + ativadas precocemente11 (dados não mostrados).

Uma limitação no protocolo é a questão do tempo (mais de 2 h no total) e o processo de várias etapas do método de coloração CXCR5 de três etapas. Alternativamente, os métodos de coloração CXCR5 de uma etapa18,33 ou 4,9,34 de duas etapas também foram aplicados na pesquisa com células TFH. Uma comparação da especificidade/sensibilidade desses métodos de coloração CXCR5 é necessária.

Em resumo, o estudo atual forneceu protocolos para acessar células TFH específicas de vírus diferenciados precocemente e investigar gene(s) interessado(s) que potencialmente regulam a diferenciação de células TFH . Esses protocolos alimentarão as investigações do comprometimento precoce do destino das células TFH .

Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Acknowledgements

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Este estudo foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32300785 a X.C.), do Programa Nacional de Pós-Doutorado da China para Talentos Inovadores (nº. BX20230449 a X.C.), e o Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2021YFC2300602 a L.Y.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Tripsina-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldeído Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μ filtro de células mMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα 2 (clone B20.1)Biolegend127812diluição 1:200
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend110724diluição 1:200
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 diluição
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) camundongoThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotina anti-camundongo F4/80 Anticorpo (clone BM8)Biolegend123106diluição 1:200
Biotina Rato anti-camundongo CD11c (clone N418)Biolegend117304diluição 1:200
Biotina Rato anti-Rato CD19 (clone 6D5)Biolegend115504diluição 1:200
Biotina Rato anti-camundongo CD8a (clone 53-6.7)Biolegend100704diluição 1:200
Biotina Rato anti-camundongo NK-1.1 (clone PK136)Biolegend108704diluição 1:200
Biotina Rato anti-camundongo TER-119/Células Eritróides (clone TER-119)Biolegend1162041:200 diluição
albumina de soro bovino, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend644816diluição 1:100
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend135220diluição 1:200
C57BL/6J (B6) camundongoThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in repórterEm casa; a linha de camundongos knock-in CXCR5-GFP foi gerada pela inserção de uma construção IRES-GFP após o quadro de leitura aberto de Cxcr5.
DMEM 10% médio MeioDMEM contendo 10% FBS
Meio DMEMGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Soro fetal bovino, FBSSigmaF8318
FlowJo (versão 10.4.0)BD Biosciences
Conjunto de tampão de coloração Foxp3/Fator de TranscriçãoInvitrogen00-5523-00O kit contém três reagentes: a. Concentrado de Fixação/Permeabilização (4X); b. Diluente de Fixação/Permeabilização; c. Tampão de Permeabilização.
Anticorpo anti-rato IgG de cabra (H + L), laboratórios de vetor biotiniladoBA-9400-1,5diluição 1:200
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemTampão
Tampão FACS contendo 0,5% BSA e 2mM EDTA
Kit de Coloração de Células Mortas Próximas ao IR Fixável LIVE/DEAD, para excitação de 633 ou 635 nmLife TechnologiesL10199diluição 1:200
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 diluição
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences561522diluição 1:50
Solução salina tamponada com fosfato, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purificado Rato Anti-Rato CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences551961diluição 1:50
PerCP monoclonal de rato anti-rato CD4 (clone RM4-5)Biolegend100538diluição 1:200
recombinante murino IL-2Gibco212-12-1MG
Tampão de lise de glóbulos vermelhosBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 meioSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 meio contendo 2% de camundongo transgênico FBS
SMARTA (SM) TCRA linha transgênica SM TCR em nosso laboratório é um presente do Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Além disso, esta linha de camundongos também pode ser obtida no The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
TampãoPBS contendo 2% de FBS e 0,01% de NaN3
Estreptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-82Diluição 1:200
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Tecnologia de sinalização celular6444S1:400 diluição
TFH tampãode coloração de células tampão FACS contendo 1% de BSA e 2% de soro
de camundongo TransIT-293 reagenteMirus BioMIRUMIR2700
de de isolamento científico ThermoFisherLCMV GP61-77 peptídeo (GLKGPDIYKGVYQFKSV) Empresa Chinesa de Peptídeos de coloração

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