As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.
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Artigo de método
Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) são um tipo de célula-tronco com potencial de diferenciação multidirecional. Em comparação com as BMMSCs derivadas de ossos apendiculares, as BMMSCs derivadas da mandíbula têm maior capacidade de diferenciação proliferativa e osteogênica, tornando-se gradualmente células sementes importantes para o reparo de defeitos da mandíbula. No entanto, a mandíbula tem uma estrutura óssea complexa e menos conteúdo esponjoso do que os ossos apendiculares. É difícil adquirir um grande número de células-tronco mesenquimais derivadas da medula da mandíbula de alta qualidade usando métodos tradicionais. Este estudo apresenta uma 'abordagem baseada em nicho sobre stemness' para isolar e cultivar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula de rato (JBMMSCs). JBMMSCs primárias de ratos foram isoladas e cultivadas usando o método aderente à medula óssea total combinado com o método de digestão de fatias ósseas. As células isoladas foram identificadas como JBMMSCs por meio de observação da morfologia celular, detecção de marcadores de superfície celular e indução de diferenciação multidirecional. As células extraídas por este método exibem uma forma de fuso 'semelhante a fibroblastos'. As células são longas, fusiformes e semelhantes a fibroblastos. A análise por citometria de fluxo mostra que essas células são positivas para CD29, CD44 e CD90, mas negativas para CD11b/c, CD34 e CD45, o que é congruente com as características das BMMSCs. As células apresentam forte capacidade de proliferação e podem sofrer diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Este estudo fornece um método eficaz e estável para obter JBMMSCs de alta qualidade suficientes com forte capacidade de diferenciação em um curto espaço de tempo, o que pode facilitar estudos adicionais sobre a exploração da função biológica, medicina regenerativa e aplicações clínicas relacionadas.
Introdução
As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descobertas pela primeira vez na medula óssea, que mostraram a capacidade de formar colônias adesivas em cultura e forte potencial osteogênico1. Pittinger et al.2 encontraram ainda seu potencial de diferenciação multidirecional em relação a ossos, gordura e cartilagem. Embora todas as células-tronco mesenquimais de diferentes fontes tenham potencial para diferenciação multidirecional, as células-tronco mesenquimais da medula óssea têm o maior potencial de diferenciação condrogênica em comparação com as células-tronco mesenquimais derivadas de outros tecidos, tornando-as conside....
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Protocolo
O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Hospital Geral do PLA Chinês. Ratos Wistar machos de treze semanas de idade foram usados para o experimento. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação experimental
- Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo tesouras oftálmicas, pinças e rongeurs ósseos, em alta temperatura e pressão.
- Prepare os meios de cultura com antecedência.
- Prepare α-MEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Pr....
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Resultados
Após 72 h de inoculação celular, a maioria das células estava suspensa e de formato redondo, com muito poucas aderidas à parede (Figura 1B). No quinto dia, surgiram colônias de células aderentes, exibindo fusos ou formas semelhantes a fibroblastos (Figura 1C). No sétimo dia, as células aderentes atingiram 90% de confluência, formando uma forma de "cardume de peixes" com um pequeno número de células suspensas intermitentes (Figura 1D.......
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Discussão
As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) representam um subconjunto de células-tronco não hematopoiéticas que residem na medula óssea, caracterizadas por suas capacidades de auto-renovação, potencial de diferenciação multidirecional e funções de suporte para hematopoiese. Essas células desempenham papéis fundamentais em vários processos fisiológicos, como regeneração tecidual, angiogênese e regulação das atividades celulares20. Consequentemente, as BMMSCs são frequentemente utilizad.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelos Projetos de Saúde do Departamento de Logística da Comissão Militar (19BJZ22), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7232154) e Fourth Mil Med Univ. projetos de pesquisa clínica (2021XB025).
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Materiais
2
Centrífuga Corning Incubadora CO 430828 Kit de Manchas de Óleo Multimodo BioTek
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de Alizarina Vermelha S 0,2% | Solarbio | G1450 | |
| BCIP / NBT Kit de Desenvolvimento de Cor de Fosfatase Alcalina | Beyotime | C3206 | |
| Bio-Rad CFX96 Sistema em Tempo Real | Bio-Rad | ||
| CCK8 Kit | Dujindo | CK04 | |
| Placa de cultura de células 10 cm | Corning | 353003 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Tubo de Centrífuga 15 mL | Tubo de | 430790 | |
| 50 mL | de | de Corning | |
| Thermo Fisher | 3111 | ||
| Oscilador de temperatura constante | Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd. | ZWY-100H | |
| Soro fetal bovino | BI | 04-001-1ACS | |
| Citômetro de fluxo | BD | FACS C6 | |
| Microscópio de contraste de fase invertido | Olympus | CKX41 | |
| Kit de Detecção de Marcadores de Superfície de Células-Tronco Mesenquimais (Rato) | Oricell | RAXMX-09011 | |
| Leitor de microplacas multifuncional | Vermelhas | Synergy LX | |
| Solarbio | G1262 | ||
| Paraformaldeído 4% | Solarbio | P1110 | |
| PBS | MACGENE | CC008 | |
| penicilina-estreptomicina 0.25% | MACGENE | CC004 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher | A25742 | |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara | RR036A | |
| Medula Óssea de Rato Células-tronco mesenquimais Kit de diferenciação adipogênica | Oricell | RAXMX-90031 | |
| Medula Óssea de Rato Células-tronco mesenquimais Kit de diferenciação condrogênica | Oricell | RAXMX-90041 | |
| Células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato Kit de diferenciação osteogênica | Oricell | RAXMD-90021 | |
| Kit de extração de RNA | TIANGEN | DP419 | |
| Bancada super-limpa | Beijing Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd. | KLCZ-1220A | |
| Tripsina-EDTA 0,25% | MACGENE | CC012 | |
| Tipo II colagenase | Solarbio | C8150 | |
| Wistar rato | Pequim Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd. | ||
| &alfa;-MEM meio de cultura | Gibco | C12571500BT |
Referências
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage poten....
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Reimpressões e permissões
