A biologia do tecido adiposo intermuscular (MAT) é amplamente inexplorada devido à acessibilidade limitada do tecido humano. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único para identificar a composição celular deste depósito adiposo único.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento de Núcleos do Tecido Adiposo Intermuscular Humano e Sequenciamento de RNA de Núcleo Único a Jusante
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo intermuscular (TAMI) é um depósito adiposo relativamente pouco estudado, localizado entre as fibras musculares. O conteúdo de IMAT aumenta com a idade e o IMC e está associado a doenças metabólicas e degenerativas musculares; no entanto, uma compreensão das propriedades biológicas do IMAT e sua interação com as fibras musculares circundantes é severamente deficiente. Nos últimos anos, o sequenciamento de RNA de célula única e núcleo nos forneceu atlas específicos de vários tipos de células de tecidos humanos. No entanto, a composição celular do IMAT humano permanece amplamente inexplorada devido aos desafios inerentes à sua acessibilidade a partir da coleta de biópsia em humanos. Além da quantidade limitada de tecido coletado, o processamento do IMAT humano é complicado devido à sua proximidade com o tecido muscular esquelético e a fáscia. A natureza carregada de lipídios dos adipócitos os torna incompatíveis com o isolamento de uma única célula. Portanto, o sequenciamento de RNA de núcleo único é ideal para obter transcriptômica de alta dimensão com resolução de célula única e fornece o potencial de descobrir a biologia desse depósito, incluindo a composição celular exata do IMAT. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único. Este protocolo permite o perfil de milhares de núcleos usando uma abordagem baseada em gotículas, fornecendo assim a capacidade de detectar tipos de células raras e pouco abundantes.
Introdução
O tecido adiposo intermuscular (TAMI) é um depósito adiposo ectópico que reside entre e ao redor das fibras musculares1. Conforme descrito em detalhes em uma revisão recente de Goodpaster et al., o IMAT pode ser detectado usando tomografia computadorizada (TC) de alta resolução e ressonância magnética (RM) (Figura 1A,B) e é encontrado ao redor e dentro das fibras musculares em todo o corpo1. A quantidade de IMAT varia muito entre os indivíduos e é influenciada pelo IMC, idade, sexo, raça e sedentarismo 2,3,4
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A amostra utilizada para esse protocolo fez parte do Estudo de Músculo, Mobilidade e Envelhecimento (SOMMA)15, que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Western IRB-Copernicus Group (WCG) e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Os participantes forneceram consentimento informado por escrito para sua participação no estudo.
NOTA: Este protocolo é adaptado de um protocolo anterior usando 100 mg de tecido adiposo subcutâneo abdominal humano em uma plataforma baseada em nanopoços16. O protocolo atual é otimizado para 50 mg de IMAT humano e preparação de bibli....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este fluxo de trabalho foi projetado para orientar o processamento de amostras IMAT humanas congeladas para obter perfis de expressão gênica em resolução de núcleo único, permitindo a identificação do tipo de célula. Aqui, uma amostra representativa do IMAT de um participante do estudo SOMMA é apresentada.
O primeiro passo de qualquer análise de dados de snRNA-seq é avaliar a qualidade dos dados para identificar núcleos de baixa qualidade, que devem ser potencialmente removidos do conjunto de .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Existem vários desafios inerentes ao trabalho com o IMAT. Além de sua acessibilidade limitada, o rendimento do material da amostra é muitas vezes muito escasso e a "contaminação" do músculo esquelético é quase impossível de evitar. Para obter a amostra de melhor qualidade, deve-se penetrar na fáscia muscular ao inserir a agulha de biópsia (para garantir que não colete tecido adiposo subcutâneo) e remover o máximo de tecido muscular possível, dissecando a amostra ao microscópio imediatamente após a coleta, seguido de proc.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Bryan Bergman, PhD da Universidade do Colorado, por fornecer a imagem da biópsia IMAT na Figura 1C do estudo MoTrIMAT (R01AG077956). Somos gratos pelo Estudo de Músculo, Mobilidade e Envelhecimento fornecer a amostra IMAT a partir da qual os dados são mostrados na seção de resultados representativos. O Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA) financiou o Estudo do Músculo, Mobilidade e Envelhecimento (SOMMA; R01AG059416) e seus estudos auxiliares SOMMA AT (R01AG066474) e SOMMA Knee OA (R01AG070647). O apoio à infraestrutura do estudo foi financiado em parte pelos Centros de Independência Americana Mais Antigos da NIA Claude D. Pep....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ Filtros de Seringa M Corning | Millipore Sigma | CLS431229 | |
| 1.7 mL Tubos de DNA LoBind | Eppendorf | 22431021 | tubos de baixa ligação |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100x inibidor de protease | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
| 10X Separador Magnético 10X | Adaptador de | ||
| Genômica 10X | |||
| Tubos canônicos de 15 mL | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| tubos cônicos de 50 mL | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
| CellRanger | Genomics | N/A | |
| Kit de acessórios Chromium iX | 10X Genomics | PN1000323 | |
| Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
| Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Contador | ||
| Countess 3 | Células Automatizado AMQAX2000 Contador de Células Thermo | Fisher Scientific | |
| Countess Slides de câmara de contagem de células | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DoubletFinder | R | N/A | |
| DPBS (sem cálcio, sem magnésio) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Kit de Índice Duplo TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genômica | PN2000048 | |
| Falcon 100 µ Filtro de células m | Corning Life Science | 352360 | |
| Falcon 40 µ Filtro de células | m Corning Life Science | 352340 | |
| Glicerina (glicerol), 50% (v/v) Solução Aquosa | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
| Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
| MACS SmartStrainers (30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
| MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Mortar and pestel | Logística de cuidados de saúde | 14075 | |
| NucBlue Live Ready Probes Reagente | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Água Livre de Nuclease (não tratada com DEPC) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Probumina Soro Bovino Albumina Livre de Ácidos Graxos, Pó | Sigma-Aldrich | 820024 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Ribolock Inibidor de RNAse | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| Seurat | R | N/A | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SUPERasin 20 U/µ L | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | ||
| Homogeneizador de tecidos | Glass-Col | 099C K54 | |
| Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
| UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
Referências
- Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
- Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipos....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
