Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.
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Artigo de método
Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os locais de contato do retículo endoplasmático (ER)-mitocôndrias desempenham um papel crítico na saúde e homeostase celular, como a regulação do Ca2+ e da homeostase lipídica, dinâmica mitocondrial, biogênese de autofagossomos e mitofagossomos e apoptose. A falha em manter o acoplamento mitocondrial ER normal está implicada em muitas doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e paraplegia espástica hereditária. É de considerável importância explorar como a desregulação dos contatos ER-mitocondriais pode levar à morte celular e se reparar esses contatos ao nível normal pode melhorar as condições neurodegenerativas. Assim, ensaios aprimorados que medem o nível desses contatos podem ajudar a esclarecer os mecanismos patogênicos dessas doenças. Em última análise, o estabelecimento de ensaios simples e confiáveis facilitará o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Aqui descrevemos um ensaio de luciferase dividida para medir quantitativamente o nível de contatos ER-mitocôndrias em células vivas. Este ensaio pode ser usado para estudar o papel fisiopatológico desses contatos, bem como para identificar seus moduladores na triagem de alto rendimento.
Introdução
As interações entre o RE e as mitocôndrias são vitais para a homeostase celular e sobrevivência 1,2,3,4. Evidências anteriores indicam que qualquer tipo de interrupção ou desregulação nos locais de contato ER-mitocôndrias pode contribuir para várias doenças neurodegenerativas, metabólicas e cardiovasculares, bem como câncer 5,6,7,8,9,10.
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Protocolo
1. Manutenção e semeadura celular (Dia 1)
- Manter HEK293T células em meios de cultura de células contendo meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (em placas de cultura de 100 mm) em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
- Antes de começar, verifique a confluência da placa visualizando ao microscópio. Quando as células atingirem aproximadamente 80-90% de confluência, prepare-se para semear as células em uma placa de cultura de 6 poços, removendo o meio e lavando com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
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Resultados
Usamos o protocolo descrito acima para medir o nível de contatos ER-mitocôndrias após a adição de três compostos conhecidos por inibir GTPases específicas. CDC42, RHO e RAC são GTPases que promovem a polimerização da actina28 quando ativadas e são inibidas por ZCL278, Rhosin e Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas com split-Rluc foram tratadas com DMSO (controle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) ou Ehop-016 (25 μM) e incubadas por 1 h, 2 h e 5 h.......
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Discussão
Usamos um ensaio de remontagem split-Renilla luciferase 8 (ensaio split-Rluc) para quantificar o nível de acoplamentos ER-mitocôndrias. Neste estudo, modificamos a construção original split-Rluc24 gerando um único vetor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, codificando cada componente split-Rluc (MitoRlucN e RlucCER) e uma sequência de peptídeo.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrame (NINDS, R01NS113516).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de Microcentrífuga SafeSeal de 1,7 mL | Sorenson | 16070 | |
| TC Tratado | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Pontas de Pipeta de 10 mL OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 10 μ Ponteiras de pipeta L OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 μ L Pontas chanfradas OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| 50 mL Polipropileno Tubo Cônico | Falcon | 352070 | |
| Racks de Microtubos de 96 Poços | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| Placa de 96 poços TC Treated | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm TC Prato Tratado | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 1250 μ Centrífuga L Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| 5910 Ri - Centrífuga Refrigerada | Eppendorf | 5943000131 | |
| Dimetil sulfóxido, anidro, ≥ 99,9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, glicose alta | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Dissolver em DMSO; armazenar a -70 ° C |
| EnduRen Substrato de Célula Viva | Promega | E6481 | Armazene alíquotas a -70 ° C |
| Eppendorf 2-20 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ Pipeta L | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 µ Pipeta L | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 canais | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ Pipeta L | Eppendorf | ||
| Soro Fetal Bovino, regiões qualificadas, aprovadas pelo USDA | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora, 184 L, Aço Inoxidável Polido | ThermoFisher Scientific | 381 | |
| Contador de contagem manual | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Células | ATCC | CRL-3216 | |
| Hemacitômetro - Neubauer Bright Line, Câmara de Contagem Dupla | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Microscópio | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini centrífuga | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Multi Tube Rack para tubos cônicos de 50 ml, cônicos de 15 ml e microcentrífugas | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Cloridrato de polietilenomina linear de grau de transfecção (MW 40.000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Hidrobrometo de poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Cloridrato de rhosina | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolver em DMSO; armazenar a -70 ° C |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Varioskan LUX leitor de microplacas multimodo | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | nível 8 |
| Sistema de aspiração a vácuo VWR | VWR | 75870-734 | |
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Dissolva em DMSO; armazene a -70 ° O |
Referências
- Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
- Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitoc....
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Reimpressões e permissões
