Este protocolo descreve um método eficiente para detectar quantitativamente o dano oxidativo do DNA em células MCF-7 pela tecnologia ELISA.
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Artigo de método
Quantificando o nível de 8-oxo-dG usando o ensaio ELISA para avaliar o dano oxidativo ao DNA em células MCF-7
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A base de 8-Oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) é a forma predominante de dano oxidativo do DNA comumente observado. O comprometimento do DNA afeta profundamente a expressão gênica e serve como um fator fundamental na estimulação de distúrbios neurodegenerativos, câncer e envelhecimento. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxoG tem significado clínico na investigação de metodologias de detecção de danos ao DNA. No entanto, atualmente, as abordagens existentes para detecção de 8-oxoG apresentam desafios em termos de conveniência, conveniência, acessibilidade e maior sensibilidade. Empregamos a técnica de ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA), um método colorimétrico altamente eficiente e rápido, para detectar variações no conteúdo de 8-oxo-dG em amostras de células MCF-7 estimuladas com diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2). Determinamos a concentração de H2O2 que induziu dano oxidativo em células MCF-7 detectando seu valor de IC50 em células MCF-7. Posteriormente, tratamos as células MCF-7 com 0, 0,25 e 0,75 mM H2O2 por 12 h e extraímos 8-oxo-dG das células. Por fim, as amostras foram submetidas a ELISA. Após uma série de etapas, incluindo espalhamento da placa, lavagem, incubação, desenvolvimento de cor, término da reação e coleta de dados, detectamos com sucesso alterações no conteúdo de 8-oxo-dG em células MCF-7 induzidas por H2O2. Por meio de tais esforços, pretendemos estabelecer um método para avaliar o grau de dano oxidativo do DNA em amostras de células e, ao fazê-lo, avançar no desenvolvimento de abordagens mais convenientes e convenientes para a detecção de danos ao DNA. Este esforço está pronto para fazer uma contribuição significativa para a exploração de análises associativas entre o dano oxidativo do DNA e vários domínios, incluindo pesquisa clínica sobre doenças e detecção de substâncias tóxicas.
Introdução
O dano oxidativo do DNA é consequência de um desequilíbrio entre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o sistema de defesa antioxidante celular1. Envolve principalmente a oxidação de bases de DNA purina e pirimidina 2,3. Essa modificação oxidativa das bases do DNA não apenas compromete a integridade do genoma, mas também abrange uma ampla gama de problemas patológicos, incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares 4,5. A base guanina no DNA tem o menor potencial de redução e é a mais susce....
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Protocolo
1. Construção de um modelo dedano oxidativo do DNA induzido por H2O2 em células MCF-7
- Recuperação de células MCF-7
- Transfira rapidamente o tubo criogênico de cultura de células, que contém 3,5 x 106 células MCF-7 e é armazenado em uma geladeira a -80 ° C, para uma caixa de espuma contendo nitrogênio líquido. Recupere o tubo com uma pinça e coloque-o em banho-maria a 37 °C em temperatura constante por aproximadamente 1 min para descongelar as células preservadas.
NOTA: Durante o processo de descongelamento em banho-maria, agite as células intermitentemente para garantir o aquecimento....
- Transfira rapidamente o tubo criogênico de cultura de células, que contém 3,5 x 106 células MCF-7 e é armazenado em uma geladeira a -80 ° C, para uma caixa de espuma contendo nitrogênio líquido. Recupere o tubo com uma pinça e coloque-o em banho-maria a 37 °C em temperatura constante por aproximadamente 1 min para descongelar as células preservadas.
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Resultados
Conforme ilustrado na Figura 3, o eixo X denota a concentração de H2O2 aplicada às células MCF-7, enquanto o eixo Y indica a viabilidade celular. O tratamento com 0,75 mM por 12 h reduziu a viabilidade das células MCF-7 para 67%. Concomitante ao aumento da concentração, houve uma diminuição significativa na viabilidade das células MCF-7, particularmente na concentração de 1,5 mM, onde a viabilidade diminuiu para menos de 3% (Tabela 1). Os resultados exp.......
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Discussão
O desenvolvimento de métodos ELISA é de grande importância para as metodologias de detecção de danos ao DNA existentes e novas. Em comparação com as técnicas tradicionais de HPLC e espectrometria de massa, essa abordagem não é apenas fácil de usar, mas também exibe alta sensibilidade e atende às demandas de triagem de alto rendimento30. Isso permite o monitoramento do 8-oxo-dG em estudos de rastreamento de doenças em larga escala, facilitando uma compreensão mais profunda da correlação entre esse .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Equipe de Pesquisa Inovadora para Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021), Programa do Centro de Pesquisa de Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), Programa de Tecnologia-Chave dos Projetos de Tecnologia de Subsistência do Povo de Suzhou (SKY2021029), Projeto Aberto do Biobanco de Recursos Clínicos de Jiangsu (TC2021B009), Projeto do Laboratório Estadual de Medicina e Proteção de Radiação, Universidade de Soochow (GZK12023013), Programas da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201) e Projeto Qing-Lan da Província de Jiangsu na China (2021, ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Kit de contagem de células-8 | Dojindo | CK04 | |
| Placa de contagem de células | QiuJing | XB-K-25 | |
| Incubadora de CO2 | Thermo | 51032872 | |
| DMEM básico (1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | Software GraphPad software | de análise estatística | |
| centrífuga de alta velocidade | Thermo | 9AQ2861 | |
| Kit ELISA Humano 8-oxo-dG | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipetas | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipetas | Rainin | 17014392 | |
| tanque de nitrogênio líquido | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Fotômetro de microplacas Multiskan FC | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Microscópio trinocular de células vivas | Motic | 1.1001E + 12 | |
| Freezer de temperatura ultrabaixa | Haire | V118574 |
Referências
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J....
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Reimpressões e permissões
