Perfil do pH luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos

Resumo

O presente protocolo descreve medidas de pH em organoides gástricos derivados de tecidos humanos usando microeletrodos para caracterização espaço-temporal da fisiologia intraluminal.

Resumo

A otimização e caracterização detalhada de modelos organoides gastrointestinais requerem métodos avançados para analisar seus ambientes luminais. Este artigo apresenta um método altamente reprodutível para a medição precisa do pH dentro do lúmen de organoides gástricos humanos 3D por meio de microeletrodos controlados por micromanipuladores. Os microeletrodos de pH estão disponíveis comercialmente e consistem em pontas de vidro chanfradas de 25 μm de diâmetro. Para medições, o microeletrodo de pH é avançado no lúmen de um organoide (>200 μm) que é suspenso em Matrigel, enquanto um eletrodo de referência repousa submerso no meio circundante na placa de cultura.

Usando esses microeletrodos para traçar o perfil de organoides derivados do corpo gástrico humano, demonstramos que o pH luminal é relativamente consistente dentro de cada poço de cultura em ~ 7,7 ± 0,037 e que medições contínuas podem ser obtidas por um mínimo de 15 min. Em alguns organoides maiores, as medições revelaram um gradiente de pH entre a superfície epitelial e o lúmen, sugerindo que as medições de pH em organoides podem ser alcançadas com alta resolução espacial. Em um estudo anterior, microeletrodos foram usados com sucesso para medir as concentrações luminais de oxigênio em organoides, demonstrando a versatilidade desse método para análises de organoides. Em resumo, este protocolo descreve uma ferramenta importante para a caracterização funcional do complexo espaço luminal dentro de organoides 3D.

Introdução

Organoides - estruturas multicelulares em miniatura derivadas de células-tronco - revolucionaram nossa capacidade de estudar a fisiologia humana e estão começando a substituir modelos animais, mesmo em ambientes regulatórios¹. Desde a descrição inicial dos organoides intestinais por Sato et al. em 2009, a tecnologia organoide tornou-se imensamente popular². Um grande número de estudos caracterizou a composição celular e a função dos modelos organoides em grande detalhe 3,4,5,6. No entanto, o e....

Protocolo

Este protocolo requer organoides 3D de pelo menos 200 μm de diâmetro que tenham um lúmen distinto e que estejam embutidos em uma matriz extracelular artificial (ECM, por exemplo, Matrigel). Os tecidos gástricos humanos para derivação de organoides foram obtidos com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Montana State University e consentimento informado de pacientes submetidos a endoscopia digestiva alta na Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, para DB) ou como amostras isentas de gastrectomia total do estômago inteiro ou gastrectomia vertical do National Disease Research Interchange (protocolo #DB062615-EX). As informações sobre as linhas organoides e....

Resultados

A secreção de ácido é uma função crucial do estômago humano. No entanto, até que ponto a secreção ácida pode ser modelada em organoides ainda é uma questão de debate 6,32,33,34. Portanto, desenvolvemos o protocolo detalhado acima para medir com precisão a produção de ácido em organoides gástricos. Notavelmente, usamos organoides derivados de células-tronco adultas não estimuladas cultivadas em .......

Discussão

O acesso limitado ao espaço luminal dos organoides restringiu severamente nossa compreensão da dinâmica fisiológica desse microambiente. Uma ferramenta confiável para análises funcionais da fisiologia luminal expandirá nossa capacidade de alavancar organoides como modelos in vitro para fisiologia, farmacologia e pesquisa de doenças. Os organoides são modelos fisiologicamente relevantes e altamente ajustáveis, com potencial adicional para replicar a variabilidade genética na população humana. Os métodos existente.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3 M KCl	Unisense
5 mL Pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estéril	CellTreat	229091B
10 mL pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estéril	CellTreat	229092B
Tubo de centrífuga de 15 mL - rack de espuma, estéril	CellTreat	229412
Placa de Cultura de Tecidos de 24 Poços, CellTreat Estéril		229124 Pipeta
Sorológica Oscilante de 25 mL, Embalada Individualmente, Papel/Plástico, Saco, Estéril	CellTreat	229093B
Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 20 mm | Tubo	MatTek	P35G-1.5-20-C
- Rack de Espuma, Estéril	CellTreat	229422
70% Etanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μ m Cell Strainer, Embalado Individualmente, Esterilizado	CellTreat	229483
1.000 µ L Pontas de Pipeta de Baixa Retenção de Comprimento Estendido, Rack, Estéril	Solução	CellTreat 229037
Anfotericina B (Fungizone)	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Gabinete de Biossegurança	Nuaire	NU-425-600	Classe II Tipo A / B3
Albumina de soro bovino	Fisher Biorreagentes	BP1605-100
Solução de recuperação celular	Corning	354253	Solução de dissociação celular
DMEM / F-12 (DMEM avançado)	Gibco	12-491-015
Modificação de Dulbecco do meio de águias (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Soro Fetal Bovino	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfato	Corning	30-234-CR
Sulfato de Gentamicina	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Ácido Livre	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-em-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Ácido clorídrico	Fisher Incubadora Científica	A144C-212
	Fisher Scientific	11676604
Câmera iPhone 12	Apple
L-glutamina	Cytiva	SH3003401
Grande Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicados Limpadores de Tarefa, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Estereomicroscópio	Leica
Matriz de Membrana Matrigel 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controlador	Unisense
Metil vermelho
MM33 Micromanipulador	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Destro
MS-15 Estágio Motorizado	Unisense
Nanoject-II	Autoinjetor de nanolitros	Drummond	3-000-204
Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microeletrodos	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	O software SensorTrace não é compatível com computadores Apple
Eletrodo de referência	Unisense	REF-RM-001652	O software SensorTrace não é compatível com Computadores Apple
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Adaptador de câmera para smartphone	Gosky
Especificações Suporte de laboratório LS	Unisense	LS-009238
Tripsina-EDTA 0,025%, vermelho de fenol	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc  RASPADORES DE CÉLULAS MINI 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dicloridrato	Tocris Bioscience	12-541-0
µ Kit de Calibração do Sensor	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4,01 e 9,21, pacotes de 20 mL

de Centrífuga 50 mL Não Revestido