Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l'imagerie optique

Summary

Cette vidéo montre des techniques pour l'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches mésenchymateuses avec des colorants fluorescents. Cette technique peut être utilisée pour un suivi in ​​vivo des cellules souches transplantées avec l'imagerie optique et des corrélations histopathologiques avec la microscopie à fluorescence.

Abstract

Imagerie optique (IO) est un outil facile, rapide et peu coûteuse pour la surveillance in vivo de nouvelles thérapies basées sur les cellules souches. La technique est basée sur l'étiquetage ex vivo de cellules souches avec un colorant fluorescent, après injection intraveineuse de cellules marquées et la visualisation de leur accumulation dans les organes cibles spécifiques ou des pathologies. La technique présentée montre comment nous appelons cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) par simple incubation avec le colorant lipophile fluorescent DID (C67H103CIN2O3S) et comment nous l'étiquette des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec la FDA a approuvé un colorant fluorescent vert d'indocyanine (ICG). Le mécanisme d'absorption se fait par l'adhésion et la diffusion du colorant lipophile travers la bicouche membranaire phospholipidique cellulaire. L'efficacité du marquage est généralement améliorée si les cellules sont incubées avec du colorant dans un milieu sans sérum, par opposition à l'incubation dans le sérum contenant des médias. Par ailleurs, l'ajout de l'agent de transfection sulfate de protamine améliore significativement l'absorption de produit de contraste.

Protocol

Étiquetage des cellules souches mésenchymateuses avec le colorant fluorescent DiD Pour commencer la procédure de marquage des cellules souches mésenchymateuses, trypsiniser et compter les cellules pour obtenir une suspension avec un nombre défini de cellules. Prenez les cellules de l'incubateur et aspirer à de vieux médias des flacons contenant les cellules à être étiquetés Laver les cellules avec 10 ml de Mg / Ca sans PBS. Aspirer le PBS. Le Mg et Ca serait inhiber la trypsi…

Discussion

OI est une technique relativement nouvelle imagerie, basée sur la détection de la fluorescence. OI est aussi sensible que les techniques d'imagerie basée sur radiotraceur, mais pas associée à une exposition à l'irradiation. OI fournit un moyen efficace de cellules de suivi de façon non invasive et répétitive, offrant ainsi un aperçu de la migration des cellules vers le site cible. Une limitation majeure de la technique est la pénétration tissulaire limité de sondes fluorescentes in vivo. Ainsi, une accumulation de trace…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Falcon	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO	10828028
b-Mercaptoethanol	Reagent	Sigma	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners Inc.